《Food Research International》：Molecular weight-dependent immunomodulatory activities of carboxymethyl pachymaran by inducing macrophage polarization via TLR4 signaling pathways
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•得到了分子量在49?kDa到655?kDa之间的多种CMPs。•分子量在52?kDa到267?kDa之间的CMP具有免疫调节活性。•分子量为112?kDa的CMP能够激活TLR4/MyD88/NF-κB以及TLR4/TRIF/IRF3通路，从而促使M1型巨噬细胞极化。•分子量为
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得到了分子量在49?kDa到655?kDa之间的多种CMPs。
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分子量在52?kDa到267?kDa之间的CMP具有免疫调节活性。
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分子量为112?kDa的CMP能够激活TLR4/MyD88/NF-κB以及TLR4/TRIF/IRF3通路，从而促使M1型巨噬细胞极化。
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分子量为49?kDa的CMP通过TLR4/TRIF/IRF3通路诱导M1型巨噬细胞极化。
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CMP分子可以嵌入TLR4受体的结合口袋中。
引言
多糖的分子量是可以被调控的（Chen等人，2022；Ferreira、Passos、Madureira、Vilanova和Coimbra，2015）。通常情况下，高分子量的多糖难以穿透细胞膜进入细胞并发挥生物活性（Feng等人，2024）。通过调控分子量，可以提升多糖的生物活性、功能及其应用潜力（Wang等人，2023）。调节多糖分子量的常见方法包括化学降解（Gao等人，2022）、物理降解（Chen等人，2025）以及酶解降解（Chen等人，2023；Cui等人，2020；Yin、Ma、Xie、Nie和Wu，2020）。
羧甲基茯苓聚糖是由茯苓多糖经过羧甲基化修饰得到的。先前的研究通过DEAE-52阴离子交换色谱法分离出了两种分子量不同的CMP（分别为126.1?kDa和172.6?kDa），并发现它们具有免疫调节活性（Liu、Liu、Feng、Ibrahim和Huang，2021）。另有研究通过调整工艺参数获得了三种分子量不同的CMP（109.0?kDa、87.8?kDa和101.6?kDa），并发现它们具有降脂作用（Pei等人，2025）。还有研究通过物理降解和酶解得到了三种分子量不同的CMP（429.8?kDa、129.9?kDa和68.6?kDa），并发现它们具有抗肿瘤活性（Zhao、Feng、Zhang、Huang和Liu，2023）。因此，通过合适的方法获得特定分子量的多糖能够展现出不同的生物活性（Su等人，2026；Wang等人，2023）。不过目前大多数研究仅针对少数几种分子量有限的多糖展开研究，缺乏关于具有生物活性的分子量范围的全面详细信息，这也就难以明确分子量与生物活性之间的关联。
多糖的分子量与其免疫调节活性之间存在密切关联（Chen等人，2023；Huang等人，2025；Li等人，2022）。多糖可以通过与模式识别受体如Toll样受体、甘露糖受体和Dectin-1特异性结合，从而触发下游信号通路的激活，进而引发多层次、持续且有效的免疫刺激反应（Ferreira等人，2015；Gao等人，2022；Zhao等人，2026）。TLR4在调节多糖引发的免疫反应中起着关键作用（Ning等人，2025）。尤其是分子量在10到1000?kDa范围内的多糖可能可以与TLR4发生相互作用（Li等人，2022）。当TLR4被激活后，通常会招募髓系分化因子88或TIR结构域含有蛋白的干扰素-β诱导因子这类适配蛋白（Zhao等人，2026）。先前的研究表明，茯苓多糖（18.38?kDa）可通过TLR4/MD2/NF-κB信号通路发挥免疫调节作用（Sun等人，2024）。同样，从茯苓中用碱提取出的分子量为11.5?kDa的多糖也被发现可通过核因子κ-B信号通路发挥免疫调节作用（He等人，2023）。同时也有研究指出，分子量过低的多糖不会表现出任何生物活性（Tian、Song、Wang和Jiang，2023）。然而，CMP失去生物活性的分子量阈值尚未确定，它是否通过其他途径发挥免疫调节作用也仍不清楚。
基于此，本研究提出假设：CMP的分子量会影响其通过TLR4/MyD88/NF-κB或TLR4/TRIF/IRF3通路引发的免疫激活作用。首先，以RAW264.7细胞中一氧化氮的分泌情况作为评估指标，初步筛选出具有免疫调节活性的CMP的分子量范围。其次，选择了三种分子量不同的CMP（CMP0、CMPD12和CMPD60），并通过FT-IR、NMR、XRD、TGA、zeta电位测定以及扫描电子显微镜等方法对其结构进行了分析。最后，通过检测RAW264.7细胞中一氧化氮、细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）、干扰素-β的分泌情况，以及mRNA表达水平、蛋白质印迹实验、共免疫沉淀、免疫荧光染色、流式细胞术和分子对接分析等手段，研究了相关的信号通路。本研究旨在为制定能够调控具有免疫激活作用的CMP的分子量策略提供理论依据，同时也为基于多糖分子量研究其结构与功能关系提供参考。
章节摘录
材料与试剂
CMP（DS 0.69，纯度≥85%）购自武汉润格生物有限公司（中国武汉）。β-葡聚糖酶（≥50 u/mg）、纤维素酶（≥50 u/mg）以及resatorvid（TAK-242）购自源恩生物科技有限公司（中国上海）。重水（D2O，氘原子占比99.8%）购自上海能源化学有限公司。鼠源巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自中国科学院（中国上海）。胎牛血清购自ExCell生物科技有限公司。
分子量与链结构的测定
如表1所示，作为对照组的CMP0的分子量为655?kDa，而随着酶解时间的延长，降解产物的分子量逐渐降低。经过β-葡聚糖酶作用0.3?小时、1?小时、12?小时、24?小时、48?小时和60?小时后，相应降解产物的分子量分别为267?kDa、186?kDa、112?kDa、67?kDa、52?kDa和49?kDa。使用纤维素酶进行相同时间段的酶解后，也得到了相应分子量的产物
结论
在本研究中，我们采用了基于酶解的分子量调控策略，制备出了13种分子量各异的各种CMP。同时筛选出了能够通过TLR4/MyD88/NF-κB或TLR4/TRIF/IRF3通路引发免疫反应的分子量范围。如图8所示，分子量为112?kDa的CMP能够同时激活TLR4/MyD88/NF-κB和TLR4/TRIF/IRF3通路，从而促进RAW264.7细胞中一氧化氮、TNF-α、IL-6、IL-1β以及干扰素-β的分泌
作者贡献说明
张丽佳：撰写——初稿、软件分析、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理。 黄文：撰写——审阅与编辑、资源获取、实验实施。 冯希：撰写——审阅与编辑、实验实施。 梅珍楠：撰写——审阅与编辑、实验实施。 刘颖：撰写——审阅与编辑、项目监督、资源协调、项目管理、实验实施、资金申请、概念构思。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了湖北省自然科学基金（编号：2025AFD498）、湖北省农业科技创新中心（编号：2025-620-000-001-027）以及湖北省农业科研体系（编号：2025HBSTX4-09）的支持。
Lijia Zhang|Wen Huang|Xi Feng|Zhinan Mei|Ying Liu
