天然鸡脾脏铁蛋白的分离与生物物理特性分析：一种高度耐热的以H链为主的纳米笼结构

《Food Research International》：Isolation and biophysical profiling of native chicken spleen ferritin: A highly thermostable H-chain-dominated nanocage

　　

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  从家禽副产品中提取出了鸡脾铁蛋白，其含量为每千克湿组织38.8毫克。
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  通过LC-MS/MS和MALDI-TOF MS技术，确定铁蛋白H链是可检测到的亚基。
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  鸡脾铁蛋白具有极高的热稳定性，其变性温度为96.3摄氏度。
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  可将家禽副产品可持续利用，用于开发食品级纳米载体。

引言

铁蛋白最初于1937年从马脾中被发现（Arosio等人，2009年），这是一种保守的铁储存蛋白，通过在其纳米笼结构中以Fe³⁺-氧氧化物纳米颗粒的形式储存过量的铁，从而在从微生物到人类的各种生物体中维持细胞内的铁平衡（Shi等人，2008年）。从结构上看，铁蛋白由24个亚基自我组装而成，形成一个球形纳米笼，外部直径约为12纳米，内部腔体直径约为8纳米，能够储存多达4500个铁原子（Xia等人，2024b年；Yang等人，2015年）。在哺乳动物中，细胞质中的铁蛋白主要由两种亚基组成：H亚基和L亚基，这两种亚基具有不同的功能（Pozzi等人，2015年）。H链含有一个铁氧化酶位点，可以结合并催化Fe²⁺的氧化，而L链则有助于Fe³⁺的生成（Arosio等人，2017年；Pozzi等人，2017年）。通过储存不稳定的铁元素，铁蛋白可以防止由于Fe²⁺/H?O?相互作用而产生的芬顿反应带来的羟基自由基（•OH）的生成，因此在减轻细胞氧化损伤方面起着关键作用（Bresgen & Eckl，2015年）。每个亚基都会折叠成四股α螺旋结构（反平行的A-B和CD对），这些螺旋结构通过BC环连接，同时还有一段短的E螺旋以60度角从螺旋轴延伸出来，形成四面体通道。这些亚基以4–3-2对称性组装在一起，形成一个八面体蛋白质外壳，在亚基接口处形成通道（Li等人，2022年）。在这些通道中，位于三重对称轴上的八个亲水通道被认为是Fe²⁺进入脊椎动物铁蛋白笼子的主要途径（Bernacchioni等人，2016年；Chandramouli等人，2016年）。

铁蛋白具有出色的环境耐受性，能够在较高的温度（70–80摄氏度）和较宽的pH范围（2.0–11.0）下保持结构完整。铁蛋白中的铁元素可以通过化学还原的方式释放到外部环境中，而不会影响该蛋白质的生物活性（Deng等人，2010年；Stefanini等人，1996年）。由于其独特的纳米笼状结构，铁蛋白不仅可以作为铁的储存载体，还可以作为钙、锌等矿物质的载体，或者装载β-胡萝卜素、姜黄素和多柔比星等功能性成分，因此它是一种多功能纳米蛋白（Liang等人，2014年；Lid等人，2018年；Song等人，2021年）。此外，有研究指出，将某些生物活性物质包裹在铁蛋白中，可以提高其稳定性或功能保持能力。例如，被包裹在铁蛋白中的花青素，其热稳定性和光稳定性大约是游离花青素的两倍（Zhang等人，2014年）。还有研究表明，绿色荧光蛋白也可以被包裹在铁蛋白中，这样包裹后的蛋白质不仅保持了较高的催化活性，还具备了耐热性（Tetter & Hilvert，2017年）。

铁蛋白在动物和植物中的组织分布有所不同。哺乳动物的铁蛋白主要存在于代谢活跃的组织中，如心脏、肝脏、脾脏和大脑（Harrison & Arosio，1996年），这些组织的亚基比例也各不相同（例如，心脏中以H亚基为主，而肝脏中则以L亚基为主）（Jutz等人，2015年），而植物的铁蛋白则主要存在于种子中（豆科植物中的含量为8–80微克/克），并且由两种H型异构体组成（Deng等人，2010年；Lukac等人，2009年）。迄今为止，已有大量研究从多种生物来源中分离出了铁蛋白，并对其进行了生化特性分析，这些来源包括豆科植物种子（如豌豆和大豆）以及哺乳动物的器官组织（包括马脾、牛脾和骆驼肝）（Deng等人，2010年；Suryakala & Deshpande，1999年）。然而，鸟类铁蛋白的物理化学性质和生物学功能仍大多未被研究，尤其是它们与已研究的同源蛋白可能存在差异之处。

近几十年来，全球肉鸡产量呈指数级增长，美国农业部预测到2025年鸡肉产量将达到1.0755亿吨。然而，工业化家禽加工会产生大量的副产品，尤其是脾脏组织，而这些组织一直未能得到充分利用。这不仅造成了蛋白质资源的巨大损失，而且由于处理不当还会给环境带来严重负担（Li等人，2025年）。鸡脾是鸡的主要外周免疫器官，已有生化研究证实其中含有铁蛋白沉积物（Cetinkaya等人，1985年）。但目前关于鸡脾铁蛋白的结构特征和生物物理特性的系统研究在文献中还极为罕见。因此，有必要对鸡脾铁蛋白的分离纯化及其功能特性进行深入研究。这类研究具有重要的经济价值和实践意义。

在本研究中，我们采用热沉淀法、分级盐析法、离子交换色谱法以及尺寸排阻色谱法，从鸡脾中纯化了鸡脾铁蛋白。通过SDS-PAGE、液相色谱-串联质谱法以及完整亚基基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法，分析了该蛋白的亚基身份和组成；通过天然PAGE、结合多角度光散射技术的SEC-MALS分析、动态光散射技术、透射电子显微镜观察以及原子力显微镜检测，研究了该蛋白的笼状结构及其形态；还通过圆二色光谱法分析了其二级结构。我们使用电感耦合等离子体光学发射光谱法测定了鸡脾铁蛋白及其无辅基形式的铁含量。同时，我们还验证了无辅基形式的鸡脾铁蛋白在体外能够氧化Fe²⁺并形成矿物核心。至于其热稳定性，则通过动态光散射技术、透射电子显微镜观察、变性/天然PAGE分析、圆二色光谱法、紫外-可见吸收光谱法、荧光光谱法以及差示扫描量热法进行了评估。

章节摘录

材料与化学品

新鲜的鸡脾（Gallus gallus domesticus）是从中国广东省云浮市的广东温佳禽类屠宰场获取的。这些鸡脾来自45天大的白羽肉鸡。屠宰后，鸡脾立即放在冰上冷却，然后在2小时内运送到实验室，并在-80摄氏度下保存直至使用。所有化学品和溶剂均为分析级或HPLC级纯度（来自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司）。

鸡脾铁蛋白的分离与纯化

新鲜鸡脾组织经过称重

鸡脾铁蛋白的分离与纯化过程

鸡脾铁蛋白的分离纯化流程如图1所示。首先将新鲜鸡脾组织进行匀浆处理，并通过加热去除其中的杂质蛋白。随后，对上清液进行逐步的硫酸铵沉淀纯化处理。之后再通过透析去除溶液中的盐分。最后的粗提物则通过离子交换色谱法进一步纯化，之后再进行尺寸排阻色谱法处理。在离子交换色谱纯化过程中，随着NaCl浓度的增加，共出现了五个洗脱峰（见图1A）。其中，第一个峰（在

结论

本研究对从一种未被充分利用的家禽副产品中分离得到的天然鸡脾铁蛋白进行了系统的生物物理特性分析。最终得到的鸡脾铁蛋白纯化率为每千克湿组织38.8毫克，其形态为直径约12纳米的球形铁蛋白状纳米笼结构。通过LC-MS/MS和完整亚基MALDI-TOF MS技术，确定H链是该铁蛋白中可检测到的亚基。通过对无辅基形式的鸡脾铁蛋白进行SEC-MALS分析，其分子量约为497.15千道尔顿，这一数值与预期相符

CRediT作者贡献说明

陈天龙：负责撰写原始草稿、方法部分、正式分析以及数据整理工作。赵雪：负责提供研究资源、参与方法设计以及争取研究经费。邵学飞：负责文章的审阅与编辑工作，同时也参与方法研究。张伟毅：负责文章的审阅与编辑工作，同时承担资源筹备任务。徐行莲：负责文章的审阅与编辑工作，同时还承担研究指导、资源协调以及经费申请等工作。

未引用参考文献

Seo和Kim，2011年

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本项研究得到了中国国家关键研发计划（编号：2024YFD2100403）以及由中国农业部资助的中国农业研究系统（CARS-41）的支持。

Tianlong Chen|Xue Zhao|Xuefei Shao|Weiyi Zhang|Xinglian Xu