《Food Research International》：Simultaneous inhibition of Listeria monocytogenes and modulation of quality attributes in Minas Frescal cheese by nanoencapsulated carvacrol
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米纳斯弗雷斯卡尔奶酪是一种在巴西广泛消费的高水分、白色、软质新鲜奶酪。由于其含水量高且缺乏成熟过程，该类奶酪为病原微生物生长，尤其是单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）提供了有利条件。新鲜奶酪对单核细胞增生李斯特菌污染尤为敏感，
米纳斯弗雷斯卡尔奶酪是一种在巴西广泛消费的高水分、白色、软质新鲜奶酪。由于其含水量高且缺乏成熟过程，该类奶酪为病原微生物生长，尤其是单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）提供了有利条件。新鲜奶酪对单核细胞增生李斯特菌污染尤为敏感，因为其兼具高水分、近中性pH以及虽经冷藏但仍允许该嗜冷病原菌生长的贮藏条件。单核细胞增生李斯特菌是一种广泛分布于环境中的革兰氏阳性病原体，其在食品加工环境中的存在与其对不利条件的适应能力有关，包括可在4至45?°C的宽温范围内生长，以及在食品接触表面形成生物被膜（biofilm，生物膜）的能力。此外，单核细胞增生李斯特菌还是人类李斯特菌病的致病因子，该病住院率和病死率较高，尤其威胁老年人、孕妇、新生儿及免疫功能低下人群。
萜类化合物2-甲基-5-(1-甲基乙基)苯酚，即香芹酚（carvacrol，CAR），是一种被普遍认为安全（GRAS）的化合物，天然存在于牛至和百里香精油中。CAR在体外以及多种食品体系中对多种食源性病原体表现出明确的抗菌活性，并且在实验模型和人体研究中显示出良好的安全性。然而，CAR直接添加于食品中的应用仍受其强烈感官属性限制，尤其是其浓烈的气味和风味。纳米包封（nanoencapsulation）已成为克服这些限制的有效技术策略，可提高天然抗菌化合物在食品体系中的稳定性，并可能降低其感官影响。在此背景下，采用奇亚黏液纳米包封CAR形成的奇亚黏液纳米颗粒（chia mucilage nanocapsules containing carvacrol，CMNP）可能是一种有前景的方法，可用于提高新鲜奶酪的微生物安全性并延长货架期。
既往研究主要关注基于CAR体系的抗菌性能，但大多数工作在体外或模型食品体系中开展，而非真实乳制品基质。此外，同时评估抗菌效力、食品品质技术效应以及体内安全性的研究仍较少。因此，仍需在真实食品体系中采用整合性研究策略，同时评价纳米包封抗菌剂的有效性与安全性。
本研究旨在评估将CMNP添加至米纳斯弗雷斯卡尔奶酪后，对单核细胞增生李斯特菌复合菌悬液行为及30?d冷藏期间理化性质的影响。此外，研究人员采用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）这一广泛用于食品化合物毒性评估的体内模型，对含CMNP奶酪进行了毒理学评价。
本文发表于《Food Research International》。该研究围绕新鲜高水分奶酪中单核细胞增生李斯特菌污染防控这一现实食品安全问题展开。米纳斯弗雷斯卡尔奶酪因高含水量、近中性pH、无成熟过程及冷藏条件下仍可支持嗜冷菌生长，成为单核细胞增生李斯特菌易于存活和扩增的高风险食品基质。现有天然抑菌剂中，香芹酚（carvacrol，CAR）具有明确广谱抗菌潜力，且安全性较好，但其直接应用于食品受限于挥发性强、稳定性不足以及强烈气味和风味对感官品质的不利影响。因此，如何在真实乳制品体系中提高CAR的稳定性和抑菌效能，同时尽量维持产品品质，并兼顾体内安全性，构成了该研究的核心问题。
基于这一背景，研究人员构建了负载CAR的奇亚黏液纳米胶囊（chia mucilage nanocapsules containing carvacrol，CMNP），并将其直接应用于米纳斯弗雷斯卡尔奶酪，系统评估其对单核细胞增生李斯特菌复合菌群的控制能力、对奶酪理化与质构特性的影响，以及在线虫模型中的急性毒性表现。研究结果表明，CMNP在奶酪中表现出优于游离CAR的抗菌性能，即便在较低CAR用量下，仍能更有效抑制单核细胞增生李斯特菌，并在冷藏贮藏过程中使其菌数多次降至检测限以下。同时，CMNP未在线虫模型中表现出体内急性毒性，并能较好维持奶酪颜色和水分活度，但会提高硬度与胶黏性，提示其在提升食品安全性的同时，也会对质构产生可测影响。总体而言，研究支持奇亚黏液纳米包封CAR作为新鲜奶酪天然抑菌递送系统的应用潜力。
研究所用主要关键技术方法可概括如下：首先，制备并表征CAR负载奇亚黏液纳米胶囊，采用动态光散射（DLS）测定粒径、分散系数（PDI）与ζ电位；其次，以3株单核细胞增生李斯特菌构建复合菌悬液，通过微量肉汤稀释与平板培养测定杀菌失活浓度（BIC）；再次，在3个独立批次米纳斯弗雷斯卡尔奶酪中开展攻毒试验，比较游离CAR与CMNP在7?°C、30?d贮藏中的抑菌效果；并结合pH、水分活度（a
w）、水分含量、色差、扫描电子显微镜（SEM）和质构剖面分析（TPA）评估品质变化；最后，以秀丽隐杆线虫N2品系对奶酪乙醇提取物进行急性暴露毒性评价。
以下为研究结果解读。
3.1. Characterization of the nanoparticles
研究人员首先对纳米颗粒体系进行了基础表征。结果显示，CMNP平均粒径为186.0?±?26.7?nm，PDI为0.32，ζ电位为?9.65?±?0.49?mV，说明所得体系粒径处于纳米尺度且分散较为均一。该结果与既往报道接近，表明本研究所采用的包封工艺具有良好重复性，并支持在本实验条件下形成相对稳定的纳米结构体系。这一结果为后续在奶酪基质中的应用奠定了制剂基础。
3.2. Bacterial inactivation concentration
通过体外杀菌失活浓度（BIC）测定，研究人员比较了游离CAR溶液（CS）与CMNP对不同单核细胞增生李斯特菌菌株及复合菌悬液的杀菌能力。结果表明，对于ATCC 7644、LM10及复合菌悬液，CMNP的BIC显著低于CS，提示纳米包封提高了CAR的杀菌效率。对于J11菌株，CMNP所需浓度高于CS，反映出菌株间存在固有敏感性差异。整体上，复合菌悬液所需抑菌浓度等于或高于其中最耐受菌株，符合混合菌群抗菌评价规律。研究据此认为，纳米包封通过降低挥发损失、延缓降解并维持活性物质在体系中的可利用性，可能增强了CAR的抗菌表现；此外，纳米尺度特征也可能促进其与细菌细胞膜的相互作用。
3.3. Inhibition of L. monocytogenes and TBC in Minas Frescal cheese
这是全文的核心结果。研究人员在米纳斯弗雷斯卡尔奶酪中进行攻毒试验，初始接种水平约为3.0 log CFU g
?1。结果显示，CMNP在加入奶酪后于第0天即可将单核细胞增生李斯特菌数量降低至检测限以下，即< 2.0 log CFU g
?1。至第5天，菌数回升至约2.6 log CFU g
?1，之后至第20天相对稳定，并在第30天再次降至检测限以下。相较之下，对照组和CS组中该菌均迅速增长，于第10天达到约7.7 log CFU g
?1。这一结果说明，在高度易感的新鲜奶酪真实基质中，游离CAR未能维持有效抑菌，而CMNP则表现出显著且持续的控制作用。
总菌落数（TBC）的变化趋势与病原菌结果相似。CMNP组在第0天同样使TBC降至检测限以下，第5天恢复至约2.5 log CFU g
?1，并维持至第20天；第10天时，对照组已达7.7 log CFU g
?1，而CMNP组仍约为2.6 log CFU g
?1。到贮藏后期，TBC未像单核细胞增生李斯特菌那样完全降至不可检，提示天然奶酪菌群中部分微生物较病原菌具有更高耐受性。研究据此指出，CMNP不仅能够控制目标病原菌，也可降低奶酪总体微生物负荷。值得注意的是，CMNP使用时CAR浓度低于CS，但表现更强，直接证明纳米包封提高了CAR在食品体系中的稳定性和生物可利用性。
3.4. Physicochemical properties of Minas Frescal cheese
在理化性质方面，研究人员检测了a
w、pH及水分含量。结果显示，各处理在整个30?d贮藏期间a
w均无显著差异，说明无论游离CAR还是CMNP均未影响奶酪的水分活度。pH方面，对照组和CS组随贮藏时间下降，反映奶酪基质发生正常酸化；而CMNP组pH在贮藏期间保持相对稳定，并在第30天显著高于对照组。该现象与CMNP持续抑菌作用相一致，即其可能通过抑制微生物代谢而限制酸生成。水分方面，CMNP组初始水分低于对照组，而CS组较高；贮藏过程中对照组和CMNP组水分有所增加，CS组变化不显著。尽管存在阶段性差异，但各组终点水分均处于米纳斯弗雷斯卡尔奶酪法规限定的高水分范围内，说明处理未破坏其基本产品属性。
3.5. Color analysis
研究人员进一步采用CIELab体系评价色泽。结果表明，L*值在各组间无显著差异，提示CMNP和CS均未导致明显变暗或失白，奶酪典型白色外观得以维持。a*值方面，CMNP组在15和30?d时较对照组更偏负值，但所有样品始终保持负值范围，说明综合色调仍位于该奶酪正常色域。b*值方面，各组均为正值，符合该类奶酪轻度黄色特征；CMNP组在部分时间点较对照组偏高，显示轻微增黄。尽管仪器色度参数存在小幅变化，但综合色差ΔE均位于0–3的可接受范围，说明这些差异在视觉上不明显，CMNP总体保持了产品自然外观与颜色稳定性。
3.6. Scanning electron microscopy analysis of cheeses containing CMNP and CS
扫描电子显微镜（SEM）结果揭示了奶酪微观结构变化。初始时，对照组呈现致密连续的蛋白网络；CS组结构较不规则且有碎裂；CMNP组则显示更均一的基质，并可见分布于蛋白网络中的圆形结构，尺寸约174.8–266.2?nm，与前述DLS表征的纳米颗粒尺寸相符，因此被认为与纳米胶囊有关。贮藏30?d后，对照组和CS组均出现更高孔隙度和更明显碎裂，尤其CS组更为显著；而CMNP组则保持更连续、均一且孔隙较少的结构。该结果说明CMNP可能参与酪蛋白网络填充与重组，增强蛋白聚集体间连接，从而形成更致密、结构更稳定的基质。这一微观观察与后续质构增强结果相互印证。
3.7. Texture profile
质构剖面分析显示，CMNP对奶酪力学性质影响最为显著。硬度方面，对照组在15?d上升后于30?d下降，CS组整体较稳定后期下降，而CMNP组在15和30?d均显著高于对照组和CS组，表明纳米包封体系使奶酪更坚实。胶黏性方面，CMNP组在15和30?d也显著增加；而内聚性在各组间无显著差异。研究将这一变化归因于奇亚黏液的水胶体特性，其既可促进水分保留，又可增强水相与酪蛋白网络的相互作用，使结合水更多地整合于结构基质中，最终形成更紧密、抗变形能力更强的凝胶网络。结合SEM结果可见，CMNP引发的结构致密化是硬度和胶黏性上升的重要基础。作者同时指出，尽管未进行感官评价，但这些质构变化可能影响消费者对产品口感与咀嚼性的感知。
3.8. Toxicological evaluation of Minas Frescal cheese containing CMNP
在安全性方面，研究人员采用秀丽隐杆线虫（C. elegans）N2野生型进行体内急性毒性评估。将线虫暴露于含CMNP、CS和对照奶酪的乙醇提取物后，48?h存活数比较显示，各处理组与对照组之间无显著差异。这说明在本研究设定条件下，无论游离CAR还是纳米包封CAR均未表现出急性体内毒性。该结果与CAR已知的良好安全性资料相一致，也为CMNP作为食品应用体系提供了初步体内安全证据。研究同时指出，这属于首次对含CAR奇亚黏液纳米胶囊食品进行体内安全性评价，但仍需进一步开展哺乳动物模型长期安全研究。
讨论部分综合表明，本研究将抗菌效果、食品品质变化与体内安全性整合于同一真实乳制品场景下进行评价，弥补了以往多停留于体外或模型体系研究的不足。研究显示，奇亚黏液纳米包封显著提升了CAR在米纳斯弗雷斯卡尔奶酪中的应用性能，使其在较低剂量下即可实现更优病原控制，并在冷藏期间维持活性；与此同时，该体系未引起明显色泽异常或水分活度变化，也未在线虫模型中产生急性毒性。需要注意的是，CMNP会导致奶酪硬度和胶黏性升高，这虽从微观结构上具有可解释性，但也意味着配方优化仍然必要。整体而言，论文证明了CMNP作为新鲜奶酪天然抗菌策略的可行性，为后续工业化应用、感官可接受性评价及制剂优化提供了实验依据。
结论部分可译为：将负载香芹酚的奇亚黏液纳米胶囊（CMNP）掺入米纳斯弗雷斯卡尔奶酪后，可通过抑制单核细胞增生李斯特菌而改善微生物控制效果，且在线虫（C. elegans）模型中未表现出体内毒性。与游离香芹酚相比，CMNP即使在较低浓度下也表现出更优的抗菌性能，凸显其作为递送系统的高效性。尽管CMNP的加入保持了奶酪色泽且不影响水分活度，但其改变了质构特性，尤其在贮藏期间提高了硬度和胶黏性，这可能影响产品品质与消费者感知。SEM分析通过显示CMNP处理奶酪在贮藏期间形成了更致密、孔隙更少的蛋白基质，对上述结果提供了支持。这些质构变化应在未来配方优化研究中予以考虑。总体而言，这些发现表明，负载香芹酚的奇亚黏液纳米胶囊可作为新鲜奶酪中的一种天然抗菌策略。未来研究应聚焦于在保持抗菌效果的同时优化配方以减轻质构变化，并开展感官评价和消费者接受度研究，以支持其未来工业应用。
