《Forensic Science International: Genetics》：Optimizing Hard Cutoff Quality Control Metrics for IBD Segment Inference and Genotyping Accuracy in Low-Coverage Sequencing Data
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摘要在低通全基因组测序中，有效的质量控制对于准确推断亲缘关系至关重要，因为低覆盖度下基因型不确定性可能影响亲缘关系的判断。我们通过全面的网格搜索，评估了在不同覆盖度下基因型后验概率和贝叶斯因子的阈值，依据假阳性率、假阴性率以及总IBD共享度的均方误差来衡量性能。在中高覆盖度（>
摘要
在低通全基因组测序中，有效的质量控制对于准确推断亲缘关系至关重要，因为低覆盖度下基因型不确定性可能影响亲缘关系的判断。我们通过全面的网格搜索，评估了在不同覆盖度下基因型后验概率和贝叶斯因子的阈值，依据假阳性率、假阴性率以及总IBD共享度的均方误差来衡量性能。在中高覆盖度（> 0.10×）下，当基因型后验概率大于0.99时，性能保持稳定，而额外的贝叶斯因子过滤则几乎无益；在低覆盖度（≤ 0.10×）下，仅使用基因型后验概率过滤就会大幅增加IBD推断的假阳性率。引入贝叶斯因子可通过对比后验基因型支持与群体等位基因频率先验来缓解这一问题。将贝叶斯因子阈值从0.3提高到100，可降低约35%的假阳性率，而更高的阈值（≥ 200）虽然能进一步降低假阳性率，但也会增加假阴性率。当贝叶斯因子大于100时，可在降低假阳性的同时保持合理的标记保留率。总体而言，仅提高基因型后验概率阈值并不能始终提升低通全基因组测序中的IBD推断精度。将贝叶斯因子与基因型后验概率结合使用，可在低覆盖度条件下提升推断稳定性，为低至中等覆盖度数据提供实用的统一质量控制策略。
引言
从质量较差或数量较少的DNA样本中推断亲缘关系是法医学领域的一项难题。全基因组测序能够检测样本的全部遗传信息，因此为生成可用于亲缘关系推断的数据提供了一种有效方法。身份遗传段是指从共同祖先那里继承来的连续染色体区域，其数量和总长度是推断亲缘关系的主要依据。检测身份遗传段依赖于足够密集且信息量充足的单核苷酸变异，通过识别个体间共享的较长基因组区域来实现。然而，全基因组测序是一种随机性测试，不同样本及同一样本内不同位置的读取数量存在差异，而且等位基因的测量也存在误差；在没有先验信息的情况下，若要可靠地判定所有位置，通常需要高覆盖度（约40×）的基因组[1]。低通全基因组测序则是一种成本更低的替代方案：虽然文库制备成本基本固定，但测序成本大致与平均读取深度成正比。此外，借助插补技术，低通基因组仍能恢复大部分常见变异[2]、[3]。另外，尽管低通全基因组测序被视为有意降低覆盖度，但法医样本本身可能天然就具有低覆盖度，有时甚至只有1×或更低。不过，将覆盖度降至1×以下会带来基因分型精度和身份遗传段推断方面的问题[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。尤其是在现实的质量控制约束下，可靠恢复身份遗传段所需的最小覆盖度至今仍未完全明确[6]、[7]、[8]。
基因型插补对于低通全基因组测序的成功至关重要。Beagle[9]、[10]、IMPUTE[11]以及GLIMPSE[2]等工具已被广泛用于提升低通全基因组测序数据的质量。不过，插补的准确性取决于覆盖度、参考群体多样性以及等位基因频率。为应对这些因素，大多数插补算法会同时估计基因型及其对应的基因型后验概率。去除基因型后验概率较低的位点可以提高准确性[3]。然而，亲缘关系推断对信息的数量和质量都很敏感，因此更精确（但数量更少）的基因型并不一定意味着更准确的亲缘关系推断结果。
此外，那些概率极高的基因型可能其实并无特殊意义。例如，如果某个参考等位基因在群体中的频率达到99.9%，那么即使没有观测到任何数据，也可以高度确定地将任何个体判定为该参考等位基因的纯合子。从身份和亲缘关系的角度来看，如果从信息量较少的低通全基因组测序样本中去除基因型后验概率较低的位点，剩余的位点可能会被人为地设定为极高精度（基因型后验概率接近1.0），从而与数据库中的绝大多数个体匹配。由于人类群体中的大多数单核苷酸变异都极为罕见[12]，这样的基因型谱也会出现较高的判定率。有人认为，插补操作会导致出现大量针对无关个体的虚假身份遗传段[13]，这可能是由于保留的位点过度受到群体先验信息的影响，而非实际证据的作用。
贝叶斯因子是另一种可用于减少虚假等位基因共享模式的质量控制指标[14]。在此研究中，贝叶斯因子通过对比后验基因型支持与先验预期，量化了观测数据在多大程度上超越群体等位基因频率先验而支持某一基因型。由于似然值会受到测序深度的影响，贝叶斯因子本质上对覆盖度很敏感：在缺乏有效数据时，贝叶斯因子会自然降至最低的支持水平，而在覆盖度足够时，则会随着实际信号的增加而上升。研究表明，贝叶斯过滤可通过减少假阳性变异判定来提升基因分型精度，尤其在低覆盖度测序中效果显著[5]、[15]。近期的低覆盖度亲缘关系推断方法采用了概率框架，整合了基因型似然值或后验概率，明确建模了身份遗传段检测过程中的基因型不确定性，从而提升了在有限测序深度条件下的稳健性[6]、[7]、[8]。
重要的是，本研究并非仅仅着眼于降低单个位点的基因分型误差。我们认为，在极低覆盖度数据中，身份遗传段推断的主要限制可能源于包含了那些虽缺乏实际证据支持，但却受群体先验强烈影响的单核苷酸变异，同时也因为去除了那些具有个体差异性的单核苷酸变异。准确的亲缘关系推断是法医遗传学、群体遗传学以及一般生物医学研究中的重要内容。尽管低通全基因组测序具有成本优势，但其较低的覆盖度给基因型判定和亲缘关系推断带来了挑战。
因此，一个尚未解决的核心问题是，质量控制指标如何随覆盖度变化，以及这种变化又会如何影响后续的亲缘关系推断。本研究评估了低通全基因组测序中质量控制性能在不同覆盖度下的变化情况，重点探讨了在保持整体基因型可靠性的同时，实现稳定、可重复的身份遗传段推断之间的平衡。我们使用了公开数据集以及自行生成的各类覆盖度数据集，分析了不同的基因型后验概率和贝叶斯因子过滤阈值所产生的影响。这些研究结果将为低通测序应用中的质量控制提供最佳实践指导，也有助于提升法医和家谱学领域的亲缘关系分析水平。
章节节选
研究设计
本研究采用两阶段设计，首先在训练数据集中优化质量控制阈值，然后在独立的测试数据集中进行验证（见图1）。在训练阶段，我们利用公开的约9×全基因组测序数据和微阵列数据，通过降采样方式生成低通全基因组测序数据集。这些数据随后经过插补处理，用于评估基因型后验概率和贝叶斯因子过滤阈值，进而用于后续的身份遗传段推断。
在
GGVP训练数据集中的基于基因型后验概率和贝叶斯因子的质量控制性能
我们首先使用通过高覆盖度测序数据降采样得到的GGVP训练数据集，评估了不同测序覆盖度下基因型后验概率阈值的影响。随着最小基因型后验概率阈值的提高，判定率下降，而基因型准确性则上升（见图2）。在较低覆盖度条件下，判定率的下降更为明显。在极低覆盖度的样本中，基因型判定率可能非常低（例如，在覆盖度为0.01×且基因型后验概率大于0.99时，判定率约为15.7%），此时
固定硬阈值策略的评估
在法医和基因组学研究中，使用固定的质量控制阈值是一种常见做法。然而，一个核心问题在于，是否有一组固定的阈值能够在不同覆盖度下保持一致的统计行为。理想的过滤策略应在覆盖度足够时能够识别出真正的身份遗传段，而当测序信息变得极为稀少时，应自然失去推断能力，而不应引入系统性偏差。在低覆盖度条件下，简单地
结论
本研究系统地评估了在低通测序数据中用于身份遗传段推断的固定硬阈值质量控制策略，发现将基因型后验概率大于0.99与贝叶斯因子大于100相结合，是一种适用于低至中等覆盖度条件的实用统一质量控制策略。虽然在中高覆盖度下，像基因型后验概率大于0.99这样的严格过滤措施能够提升基因分型精度，但在极低覆盖度下，它们可能会通过去除有信息价值的单核苷酸变异并降低标记密度，而对亲缘关系推断产生负面影响。在经过降采样的训练数据中
CRediT作者贡献说明
黄梦：撰写——初稿、可视化、验证、软件、方法论、研究、正式分析、数据整理。雪莉·休斯：撰写——审阅与编辑、资源获取、资金筹集、数据整理。梅利莎·穆恩兹勒：撰写——审阅与编辑、数据整理。奥古斯特·E·沃纳：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、项目管理、方法论、研究、资金筹集、数据整理、概念构建。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
黄梦|雪莉·休斯|梅利莎·穆恩兹勒|奥古斯特·E·沃纳
美国德克萨斯州沃思堡市坎普鲍伊大道3500号，北德克萨斯大学健康科学中心人类鉴定中心，邮编76107
