猪细胞全基因组规模代谢模型：培养肉工业过程优化与设计的工具

《Future Foods》：A comprehensive genome-scale metabolic model for porcine cells as a tool for process optimization and design in the cultivated meat industry

　　

培养肉具有减少传统肉类生产环境足迹的潜力；然而，培养基的高成本仍然是大规模实施的主要障碍，这促使研究人员努力更好地理解和优化细胞代谢。研究人员在此提出iSSC2487，一个经过精心筛选的高质量猪（Sus scrofa）基因组规模代谢模型（genome-scale metabolic model, GEM），包含2,487个基因、9,124个反应和6,790个代谢物，分布于九个细胞区室，并正确再现了九种经典必需氨基酸的必需性。来自40 L补料分批培养（fed-batch culture）中猪胚胎干细胞的实测摄取和分泌速率被用于约束动态通量平衡（dynamic flux balance, dFBA）模拟，这些模拟再现了观察到的生物反应器中生物量和胞外代谢物的轨迹。利用这一数据约束框架，研究人员绘制了碳和氮的细胞内路由，解析了其在早期、指数期和晚期生长阶段的差异，并识别了降低成本的培养基改良方案。通量分布揭示了碳的逐步重路由和以谷氨酰胺为中心的溢流代谢（overflow metabolism），其中转氨作用生成了分泌的丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，且随着生长速率降低，副产物分泌减少。iSSC2487识别了包含27种必需营养素的最小培养基。研究人员提供了一种符合代谢需求的饲料配方，其成本为10 USD L^-1，而基于混合整数线性规划（mixed-integer linear programming, MILP）的优化进一步将预测成本降低至6.5 USD L^-1（降低35%）。尽管这些模型引导的预测仍有待实验验证，但该重建为未来工作（包括猪细胞培养中的组学整合和生物过程优化）提供了一个通用框架。

**论文解读：猪细胞基因组规模代谢模型iSSC2487促进培养肉工业过程优化与设计**

**研究背景与问题**

培养肉（cultivated meat）作为一种替代传统畜牧生产的可食用动物肌肉和脂肪组织，具有减少土地使用、水资源消耗、能源消耗和温室气体排放的潜力。然而，实现成本竞争力的大规模生产仍面临巨大挑战，其中培养基成本可占生产总费用的90%。细胞增殖速率慢和营养丰富的培养基的高成本是主要瓶颈。因此，深入理解大规模培养条件下细胞代谢和营养利用，对于优化生物过程条件、培养基组成和细胞代谢至关重要。计算建模，特别是基因组规模代谢模型（genome-scale metabolic model, GEM），能够通过约束性方法（如通量平衡分析，flux balance analysis, FBA）整合基因组知识与生化反应网络，推断营养依赖性、识别代谢瓶颈并模拟细胞行为。尽管已有针对中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、人胚胎肾（HEK293）细胞等哺乳动物细胞的GEM，但针对猪（Sus scrofa）细胞的全面GEM仍缺乏，限制了其在培养肉生产中的应用。

**研究内容与结论**

研究人员开发了iSSC2487，一个涵盖9个细胞区室、包含2,487个基因、9,124个反应和6,790个代谢物的猪细胞全基因组规模代谢模型。该模型正确预测了九种经典必需氨基酸的必需性。通过整合来自40 L补料分批培养（fed-batch culture）中猪胚胎干细胞的实测摄取和分泌速率，利用动态通量平衡分析（dynamic flux balance analysis, dFBA）模拟了生物反应器中的生物量和代谢物动态。研究揭示了碳和氮的细胞内路由在早期、指数期和晚期生长阶段的差异，并识别了以谷氨酰胺为中心的溢流代谢（overflow metabolism），其中转氨作用生成分泌的丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。模型还识别了包含27种必需营养素的最小培养基，并基于混合整数线性规划（mixed-integer linear programming, MILP）优化了培养基配方，将预测成本从10 USD L^-1降至6.5 USD L^-1（降低35%）。该论文发表在《Future Foods》。iSSC2487为培养肉工业中的组学整合和生物过程优化提供了一个通用框架。

**关键技术与方法**

研究人员主要采用以下关键技术方法：（1）基于模板法（以人类基因组为模板）和数据库法（KEGG）构建基因组规模代谢模型，并通过手动筛选、缺口填充（gap-filling）和一致性验证优化模型；（2）利用来自Meatable B.V.的40 L补料分批培养数据（猪胚胎干细胞悬液培养），计算特异性摄取和分泌速率，约束动态通量平衡分析（dFBA）；（3）采用简约通量平衡分析（parsimonious flux balance analysis, pFBA）解析细胞内通量分布；（4）通过混合整数线性规划（MILP）确定最小培养基和成本优化培养基。

**研究结果**

**2.1 生成iSSC2487，一个猪全基因组规模代谢模型**
研究人员遵循标准重建协议，以人类（Homo sapiens）为模板，利用MetaDraft和RAVEN工具箱构建初始模型，添加了14个猪特异性反应（如抗坏血酸合成、苏氨酸醛缩酶催化的甘氨酸合成、尿酸酶催化的尿酸降解）。手动筛选后，通过缺口填充确保生物量生成。最终模型包含2,487个基因、9,124个反应和6,790个代谢物，分布于9个细胞区室。与已报道的PigGEM2025核心模型（504个反应）相比，iSSC2487覆盖面更广。模型正确预测了九种必需氨基酸的必需性，并通过MEMOTE评估确认了质量（质量和电荷一致性>99%，注释完整性99%）。

**2.2 iSSC2487在实测交换速率约束下再现工业补料分批过程中的代谢物动态**
研究人员对40 L补料分批培养的9个反应器数据进行归一化和时间对齐，计算了早期、指数期和晚期生长阶段的特异性生长速率、摄取和分泌速率。利用这些速率约束dFBA模拟，模型成功再现了生物量和21种代谢物的浓度轨迹。葡萄糖和必需氨基酸持续消耗，乳酸、氨、天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸分泌并积累。阶段解析的产率显示，早期阶段代谢物消耗和分泌最活跃，指数期次之，晚期最小。乳酸和氨的分泌产率在早期和指数期最高，而非必需氨基酸（如甘氨酸、脯氨酸）的摄取产率在晚期增加。

**2.3 iSSC2487代谢通量分布揭示氨基酸相互转化导致副产物形成**
研究人员利用pFBA在实验交换速率约束下计算细胞内通量分布。碳经济分析表明，葡萄糖贡献的碳比例从早期（11%）增加到晚期（54%），而谷氨酰胺贡献的碳比例从早期（50%）下降到晚期（12%）。早期代谢中，约51%的摄入碳以乳酸、分泌氨基酸和含氮废物形式损失，仅33%保留于生物量；晚期保留比例升至60%。乳酸是最大的溢流产物，CO₂是最大的总输出。谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为谷氨酸，再转化为α-酮戊二酸进入三羧酸循环，在指数期达到峰值。生长归一化通量显示，乳酸溢流在晚期降低约7倍，而呼吸CO₂基本恒定，表明细胞主动转向更氧化、更碳保守的状态。通量分布还揭示了细胞内广泛的氨基酸相互转化，通过减少成本分析（reduced cost analysis）识别了氨基酸的替代潜力（如甘氨酸可由丝氨酸合成）和共消耗关系（如半胱氨酸与甲硫氨酸共消耗）。

**2.4 iSSC2487揭示最小营养需求并支持设计低成本培养基**
研究人员通过MILP确定维持生长所需的最小营养素集，包含27种必需营养素（9种必需氨基酸、16种维生素、氧气和磷酸盐）。为达到最大特异性生长速率，还需补充葡萄糖、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和酪氨酸。基于指数期实验摄取比例设计的最优饲料配方成本为10 USD L^-1。通过MILP成本优化，将预测成本降至6.5 USD L^-1（降低35%），优化中识别出脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和天冬酰胺非必需，半胱氨酸在80%最大生长速率下非必需。敏感性分析显示，该优化对半胱氨酸和甲硫氨酸不确定性稳健（成本变化最多12.35%）。若将精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸强制作为必需营养素，优化成本上升19%，但仍可维持生长。

**讨论与结论**

研究人员指出，iSSC2487的dFBA结果应视为拟合过程而非预测，因为数据用于约束模型。在工业数据背景下，通过归一化和时间对齐处理高变异性，模型不仅再现了平均趋势，还能捕捉单个反应器动态（生物量和中心代谢物拟合优度95%和88%）。与PigGEM2025模型的比较显示，iSSC2487保留完整细胞区室和生物合成途径，正确预测了九种必需氨基酸，而PigGEM2025额外要求精氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。模型局限性包括：动态模拟仅基于单一pEPiSC悬液补料分批系统，生物量目标函数沿用人类模板，缺乏组学约束，以及未考虑培养基中未公开成分。未来方向包括整合蛋白质组或转录组数据构建蛋白质组约束模型，以及耦合反应器尺度描述。

研究结论：iSSC2487提供了一个全面的、多区室的猪代谢重建，可整合组学数据，在40 L补料分批数据约束下解析了碳和氮的细胞内路由，刻画了路由在早期、指数期和晚期阶段的变化，并支持设计低成本培养基。该模型将实测补料分批行为转化为一致的代谢图景，将溢流代谢重新定义为阶段依赖且部分可控的碳分配策略，为改善猪细胞培养提供了可检验的假设。