《International Journal of Antimicrobial Agents》：Integrated multi-omics profiling reveals the role of the cfa gene in mediating penicillin antibiotics resistance and stress adaptability in Shigella sonnei
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•cfa基因是志贺氏菌产生青霉素类抗生素抗性的关键因素。•多组学分析表明，cfa基因在志贺氏菌中调控硫代谢，并协调半胱氨酸与甲硫氨酸的生物合成途径。•cfa基因在细菌的适应性反应中起着重要作用。引言志贺氏菌感染在全球范围内十分普遍，是导致儿童腹泻死亡的主要原因[1,2]。不仅如此
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cfa基因是志贺氏菌产生青霉素类抗生素抗性的关键因素。
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多组学分析表明，cfa基因在志贺氏菌中调控硫代谢，并协调半胱氨酸与甲硫氨酸的生物合成途径。
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cfa基因在细菌的适应性反应中起着重要作用。
引言
志贺氏菌感染在全球范围内十分普遍，是导致儿童腹泻死亡的主要原因[1,2]。不仅如此，每年还有超过1.6亿例志贺氏菌感染病例，以及110多万例死亡病例[3]。这类感染在低收入和中等收入国家尤为高发，给这些国家的医疗系统及家庭带来了沉重负担[4,5]。根据O抗原的不同，志贺氏菌可被分为四种血清型：志贺痢疾菌、弗莱克斯纳志贺菌、宋内志贺菌和博伊德志贺菌。其中，志贺痢疾菌的毒性最强，临床症状更为严重，死亡率较高，且容易在人群中引发大规模爆发[6]。而宋内志贺菌和弗莱克斯纳志贺菌则是细菌性痢疾的主要致病菌。研究表明，在发达国家，宋内志贺菌更为常见，而在发展中国家则以弗莱克斯纳志贺菌为主。近年来，发展中国家中宋内志贺菌感染的比例不断上升，已成为细菌性痢疾的主要致病菌[7,8]。综上所述，宋内志贺菌已成为志贺氏菌感染中的主要病原体，应当受到高度重视。
抗生素是治疗细菌或其他病原微生物感染的重要手段，为人类健康做出了巨大贡献。然而，由于抗生素的滥用，志贺氏菌对各类抗生素的耐药性日益增强，这一问题现已成为全球范围内的重大公共卫生问题[9,10]。世界卫生组织推荐环丙沙星和第三代头孢菌素作为治疗细菌性痢疾的首选药物。但监测数据显示，包括中国和印度在内的多个国家都存在广泛存在的环丙沙星耐药性志贺氏菌[[11], [12], [13], [14]]。对弗莱克斯纳志贺菌2a血清型菌株的回顾性分析显示，近一半的菌株对环丙沙星具有耐药性（50.7%，77/152）[15]。尽管存在耐药性，在缺乏可靠药敏检测条件的资源匮乏地区，尤其是非洲和东南亚农村地区，氨苄西林仍然是治疗志贺菌病的一种实用选择[16]。在肯尼亚内罗毕地区，导致儿童腹泻的细菌病原体中，氨苄西林的耐药率高达70%以上[17]。志贺氏菌的耐药性问题日益严重，给细菌性痢疾的临床治疗带来了极大挑战。因此，研究其耐药机制具有极其重要的意义，不仅对公共卫生有着重要价值，还具有显著的社会经济价值。
环丙烷脂肪酸（CFA，C19:0）是细菌磷脂的重要组成部分，它由基因编码的CFA合成酶合成，存在于细菌、植物和寄生虫等众多生物体内[[18], [19], [20], [21], [22]]。研究表明，通过过表达基因增加细胞膜中CFA的比例，可改变细胞膜的属性，比如提高其对小分子的通透性，同时增加细胞膜的流动性[23,24]。这一特性还能帮助细菌更好地应对外部压力，如抗生素耐药性、耐酸性以及抗氧化能力[[25], [26], [27], [28], [29], [30]]。不过，基因究竟如何调控志贺氏菌的耐药机制，目前尚不完全清楚。
先前的研究已在敏感的宋内志贺菌菌株（以下简称WT）中诱导出了对氨苄西林的耐药性，随后利用同源重组技术，以该耐药菌株（Res）为模板构建了基因敲除菌株（Δcfa）。研究发现，WT菌株与Res菌株之间的基因mRNA表达水平存在3倍以上的差异（P<0.05），这表明基因可能在宋内志贺菌的耐药过程中起作用。随后进一步比较了Res菌株和Δcfa菌株对各类抗生素的敏感性，并通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学方法，筛选出两者的差异表达mRNA、蛋白质和代谢物。此外，还通过细菌生长曲线分析、生物膜形成试验以及Cell Counting Kit-8检测，比较了两种菌株在生长状态、生物膜形成能力以及毒力表现方面的差异。这项研究的目的是探究基因在宋内志贺菌耐药机制中的作用，为预防和治疗志贺氏菌感染，尤其是耐药性志贺氏菌感染，提供新的思路和药物靶点。
章节要点
细菌、质粒与细胞
我们的实验室保存有宋内志贺菌（WT）、DH5α、SA、F1、F2、H1、H2、pKD46、pKD4、pCP20以及pET28a等菌株。临床分离株的抗菌药敏试验结果见表S1。Res菌株是通过先前的研究方法[31]，在WT菌株基础上经实验室抗生素诱导进化得到的。本研究还构建了突变菌株Δcfa以及互补菌株Δcfa/pcfa。这些菌株均在Luria-Bertani培养基上过夜培养，以便分离单个菌落，之后再
宋内志贺菌 Δcfa突变菌株与互补菌株的构建
我们之前的研究发现，在氨苄西林诱导产生的耐药菌株Res以及对左氧氟沙星和头孢菌素具有耐药性的临床分离株F1、F2、H1和H2中，基因的表达水平都很高（P<0.05，见图1A）。临床分离株的抗生素耐药谱见表S1。因此，在本研究中，我们构建了基因敲除菌株和互补菌株用于进一步研究。通过交叉PCR技术，利用内部引物cheak-cfa-F/R和外部分子探针，对突变菌株进行了验证
讨论
虽然抗生素在治疗细菌性痢疾方面效果显著，但随着抗生素的广泛使用，志贺氏菌对其的耐药性也日益普遍。基于本研究构建的氨苄西林耐药菌株Res，以及Δcfa突变菌株和Δcfa-pcfa互补菌株，我们发现敲除基因后，宋内志贺菌对青霉素和头孢菌素类抗生素的敏感性有所提升。通过转录组学、蛋白质组学等分析方法，
资金支持
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82073618）的支持。
