金丝桃苷通过外泌体介导的JNK/MAPK信号通路调节，缓解年龄相关性黄斑变性样视网膜损伤中的视网膜色素上皮细胞损伤

《International Immunopharmacology》：Kinsenoside alleviates retinal pigment epithelium cell injury in age-related macular degeneration-like retinal injury through exosome-associated modulation of JNK/MAPK signaling

　　

摘要

背景

干性年龄相关性黄斑变性主要由视网膜色素上皮细胞损伤引发。金丝桃苷具有保护视网膜色素上皮细胞的活性，但其对干性黄斑变性的直接影响及相关分子机制尚不清楚。

目的

本研究旨在探讨金丝桃苷对干性黄斑变性中视网膜色素上皮细胞损伤与功能障碍的保护作用，并阐明其调控机制。

方法

本研究建立了A2E和蓝光诱导的ARPE-19细胞损伤模型以及蓝光诱导的类似黄斑变性的视网膜损伤小鼠模型。检测了视网膜色素上皮细胞的细胞毒性、凋亡、衰老、炎症反应以及与黑色素生成相关的标志物表达情况。通过Western blotting分析MAPK信号通路，还利用JNK抑制剂、分子对接分析、体外JNK酶活性测定、外泌体特征分析及外泌体功能测定等方法探讨其作用机制。

结果

金丝桃苷处理显著降低了类似黄斑变性ARPE-19细胞中的细胞毒性、凋亡、细胞衰老、炎症反应以及与黑色素生成相关的标志物异常。在体内实验中，金丝桃苷减少了类玻璃膜疣沉积，改善了视网膜结构完整性，部分恢复了外核层厚度，同时抑制了细胞衰老和炎症反应。从机制上看，金丝桃苷在所研究的条件下能优先抑制病理性JNK激活，并降低体外JNK的酶活性。药物性JNK抑制可产生与金丝桃苷相似的保护作用，且无额外益处，表明二者作用途径存在重叠。外泌体抑制、转移及耗竭实验则支持外泌体相关信号通路在金丝桃苷介导的细胞保护中的作用。

结论

这些研究结果表明，金丝桃苷可通过外泌体相关途径调节JNK/MAPK信号通路，从而减轻类似黄斑变性条件下的视网膜色素上皮细胞损伤。

引言

年龄相关性黄斑变性是老年人出现不可逆视力损害和失明的主要原因，随着全球人口老龄化，其患病率也在持续上升[1]。临床上，黄斑变性主要分为干性（萎缩型）和湿性（新生血管型）两类，其中干性黄斑变性占所有病例的80%以上[2]。虽然抗VEGF疗法显著改善了湿性黄斑变性的治疗效果，但目前针对干性黄斑变性的有效且被广泛认可的疾病修饰疗法仍然有限[1]。目前，对于早期和中期干性黄斑变性的治疗策略主要依靠生活方式调整和营养补充，以延缓疾病进展，但这些方法效果有限，也无法解决疾病的根本病理机制[3]。对于伴有地理性萎缩的晚期干性黄斑变性，目前只有阿瓦辛卡普特 pegol和佩格塞塔考普兰两种药物获得美国FDA批准，它们可通过抑制补体系统来减缓视网膜退化，但无法恢复受损的光感受器或视力功能[4]。因此，导致干性黄斑变性进展的病理机制以及有效的治疗靶点仍需进一步明确。

视网膜色素上皮在维持视网膜稳态中起着关键作用，它负责支持光感受器的代谢、吞噬光感受器的外段盘结构、维持外血-视网膜屏障以及调节局部免疫微环境[5]。越来越多的证据表明，视网膜色素上皮细胞的损伤和功能障碍是干性黄斑变性发生和发展过程中的核心病理现象，包括补体级联反应的激活、由此引发的氧化应激和细胞死亡以及线粒体功能障碍[6]。基于这一病理背景，旨在保护视网膜色素上皮细胞存活、延缓其功能障碍和衰老的治疗策略对于干性黄斑变性的预防和治疗具有重要意义[7]、[8]、[9]。从机制层面来看，针对抗炎和抗氧化信号通路的干预措施已被证明能够有效维持视网膜色素上皮细胞的结构完整性和功能稳定性。例如，一种具有明确抗炎和抗纤维化作用的富含亮氨酸的小型蛋白聚糖——decorin，可通过激活AMPK/mTOR信号轴并增强自噬作用，保护视网膜色素上皮细胞免受过氧化氢诱导的氧化应激和细胞凋亡[10]。除了单一分子干预外，一种源自传统中药的制剂——朱景丸，也被报道可通过激活Nrf2抗氧化通路并同时抑制Akt/GSK3β信号通路，缓解视网膜色素上皮细胞因氧化应激而发生的上皮-间质转化，进而改善黄斑变性小鼠模型的视网膜病变状况[11]。

值得注意的是，金丝桃苷是一种从石斛属植物中提取的天然糖苷化合物，已被证实具有广泛的抗炎、抗氧化和细胞保护作用[12]。先前的研究表明，金丝桃苷可通过清除过多的活性氧并抑制炎症反应，减轻高血糖引起的细胞损伤[13]。此外，在四氯化碳诱导的肝脏损伤模型中，金丝桃苷可显著降低MAPK信号通路中ERK1/2、p38和JNK等关键下游激酶的活性，从而发挥保肝作用[14]。在眼部相关研究中，金丝桃苷联合使用可减轻氧化应激，保持视网膜色素上皮细胞的存活能力，并逆转过氧化氢诱导的细胞凋亡[15]。此外，金丝桃苷还能通过抑制ERK1/2、p38和NF-κB介导的炎症信号通路，抑制人类脐静脉内皮细胞在受损视网膜色素上皮细胞条件培养液刺激下的血管生成反应，这表明它在包括干性黄斑变性在内的视网膜退行性疾病中可能具有潜在作用[15]。然而，金丝桃苷在蓝光诱导的类似干性黄斑变性病理过程中的具体作用及其相关分子机制尚未得到系统研究。

基于上述背景，本研究采用了体外和体内相结合的实验策略，系统评估了金丝桃苷在类似黄斑变性应力条件下对视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用。通过建立A2E和蓝光诱导的ARPE-19细胞模型以及蓝光诱导的类似黄斑变性的视网膜损伤小鼠模型，全面分析了金丝桃苷对视网膜色素上皮细胞凋亡、衰老、炎症反应以及与黑色素生成相关标志物表达的调控作用。此外，还通过MAPK信号通路分析、JNK药物抑制、分子对接预测以及外泌体相关功能分析等方法，探讨了金丝桃苷介导细胞保护的分子机制。总体而言，这些研究结果为金丝桃苷在类似黄斑变性应力条件下缓解视网膜色素上皮细胞损伤的治疗潜力提供了新的机制依据。

章节节选

伦理声明

所有动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院制定的《实验室动物护理和使用指南》以及ARVO发布的《眼科和视觉研究中的动物使用声明》进行，并已获得福建医科大学附属第一医院动物实验伦理委员会的批准（批准编号：IACUC FIMU 2023–0137）。实验用小鼠饲养在具备控制环境的无特定病原体动物设施中。

金丝桃苷可减轻类似黄斑变性ARPE-19细胞中的细胞凋亡和细胞衰老

金丝桃苷是一种从石斛属植物中提取的天然糖苷化合物。它由一个含有多个羟基的葡萄糖衍生的吡喃环构成，因此具有较高的亲水性，该糖环通过糖苷键与一个内酯结构相连（图1A）。为了确定后续实验的适宜浓度，首先在基础培养条件下评估了金丝桃苷在ARPE-19细胞中的基础细胞毒性。单独使用100、200和400微摩尔的金丝桃苷并未对细胞产生显著影响。

讨论

在本研究中，通过建立A2E/蓝光诱导的ARPE-19细胞损伤模型以及蓝光诱导的类似黄斑变性的视网膜损伤小鼠模型，从细胞和组织层面评估了金丝桃苷的保护作用，并探讨了其作用机制。金丝桃苷可减轻细胞毒性、细胞凋亡、细胞衰老、炎症活化以及与黑色素生成相关的标志物异常。从机制上看，金丝桃苷在所研究的条件下能优先抑制JNK/MAPK信号通路，并降低JNK的活性。

CRediT作者贡献说明

白月：论文撰写——初稿撰写，概念构思。 谢茂松：验证，实验研究，定量分析，数据整理。 姚义华：验证，实验研究，定量分析，数据整理。 周碧婷：验证，实验研究，定量分析，数据整理。 朱义华：论文撰写——审阅与编辑，概念构思。

资金支持

本研究得到了教授发展基金（JS14019）、福建省眼病与视光学临床医学研究中心（YK-YJZX）、福建福民基金会以及中国国家自然科学基金（编号：82271079）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本论文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

白月|谢茂松|姚义华|周碧婷|朱义华

中国福建省福州市350000，福建医科大学附属第一医院眼科