二氢杨梅素通过抑制JAK2/STAT3相关NF-κB炎症和凋亡信号减轻胆汁淤积性肝损伤

《International Immunopharmacology》：Dihydromyricetin attenuates cholestatic liver injury by suppressing JAK2/STAT3-associated NF-κB inflammatory and apoptotic signaling

　　

背景：胆汁淤积性肝损伤（CLI）主要由肝内胆汁酸积聚驱动，促进肝细胞损伤、炎症、氧化应激和凋亡。二氢杨梅素（DHM）是一种来自显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的生物活性黄酮类化合物，具有肝脏保护潜力，但其在CLI中的作用和机制尚不清楚。方法：研究人员利用网络药理学、公共转录组分析和分子对接预测DHM在CLI中的候选靶点。分别使用牛磺胆酸（TCA）处理的HepaRG细胞和α-萘异硫氰酸酯（ANIT）处理的小鼠作为体外和体内模型，并以熊去氧胆酸（UDCA）作为阳性对照。评估了肝损伤、炎症、氧化应激、凋亡、JAK2/STAT3相关NF-κB信号、胆汁酸相关分子和胆管反应标志物。通过AG490介导的通路抑制和IL-6介导的STAT3再激活来评估STAT3信号的功能参与。结果：DHM提高了细胞活力，并降低了TCA诱导的ALT、AST、LDH、ALP和炎症细胞因子水平。网络药理学将STAT3、AKT1、SRC、ESR1和MMP9确定为枢纽靶点，而公共转录组和富集分析则突出了炎症、凋亡、NF-κB和JAK/STAT相关通路。DHM减轻了TCA诱导的凋亡，并抑制了JAK2/STAT3相关的NF-κB激活，包括减少p65核转位。DHM还在体外调节了胆汁酸稳态相关分子。在ANIT处理的小鼠中，DHM改善了肝脏组织学，降低了ALT、AST、ALP、TBA、炎症细胞因子和氧化应激，并抑制了肝脏凋亡和JAK2/STAT3-NF-κB信号。AG490模拟了DHM的保护作用，而IL-6介导的STAT3再激活部分削弱了DHM介导的保护。结论：DHM通过抑制炎症、氧化应激和肝细胞凋亡来缓解CLI，至少部分是通过抑制JAK2/STAT3-NF-κB信号轴实现的。

**论文解读：二氢杨梅素通过抑制JAK2/STAT3相关NF-κB信号减轻胆汁淤积性肝损伤**

**研究背景与问题**
胆汁淤积性肝损伤（CLI）是一种由肝内胆汁酸积聚驱动的复杂病理生理综合征，其特征包括肝细胞损伤、炎症浸润、氧化应激和细胞凋亡。持续的胆汁酸滞留是CLI的核心致病事件，可导致肝细胞坏死、胆管反应、炎症放大和细胞死亡。若未有效控制，慢性胆汁淤积性损伤可能进展为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭甚至死亡。尽管CLI的发病机制涉及遗传、免疫、代谢和药物相关因素，但其精确分子机制尚未完全阐明。目前临床治疗主要依赖胆汁酸调节剂如熊去氧胆酸（UDCA），但部分患者反应不完全，而奥贝胆酸（OCA）可能因瘙痒等副作用受限。因此，寻找更安全有效的治疗候选药物是肝病领域的重要挑战。二氢杨梅素（DHM）是从显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）中提取的主要黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗微生物和抗肿瘤等多种生物活性，已有研究显示其在不同肝损伤模型中发挥保护作用，但其在CLI中的作用和机制尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明DHM对CLI的保护作用及其分子机制。

**研究内容与结论**
研究人员整合了网络药理学、公共转录组分析、分子对接和实验验证，系统评估了DHM对牛磺胆酸（TCA）处理HepaRG细胞（体外模型）和α-萘异硫氰酸酯（ANIT）处理小鼠（体内模型）的保护作用，并以UDCA作为阳性对照。结果表明，DHM通过抑制JAK2/STAT3相关NF-κB炎症和凋亡信号，减轻了肝细胞损伤、炎症、氧化应激和凋亡，同时部分调节了胆汁酸稳态相关分子和胆管反应标志物。该研究为DHM作为CLI潜在治疗候选药物提供了实验证据，论文发表在《International Immunopharmacology》。

**主要技术方法**
1. 网络药理学：利用SwissTargetPrediction、PharmMapper、BATMAN-TCM等数据库预测DHM靶点，结合GeneCards、OMIM、DisGeNET获取CLI相关基因，取交集后构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，通过CytoNCA插件识别枢纽基因（AKT1、SRC、STAT3、MMP9、ESR1）。
2. 分子对接：使用CB-Dock2服务器（基于AutoDock Vina）评估DHM与枢纽蛋白的结合亲和力。
3. 公共转录组分析：从GEO数据集GSE285689（包含胆管结扎诱导CLI小鼠的原代肝细胞转录组）提取表达数据，进行差异表达分析和基因集富集分析（GSEA）。
4. 实验验证：采用TCA处理HepaRG细胞（体外）和ANIT口服灌胃诱导C57BL/6J小鼠CLI模型（体内），通过CCK-8、生化检测、ELISA、流式细胞术、Western blot、qRT-PCR和组织病理学评估肝损伤、炎症、氧化应激、凋亡和信号通路。使用AG490（JAK2/STAT3抑制剂）和IL-6（STAT3激活剂）进行药理学干预。

**研究结果**
**3.1 DHM保护HepaRG细胞免受TCA诱导的肝细胞损伤**
通过CCK-8筛选，确定200 μM TCA和80 μM DHM为实验浓度。DHM显著恢复了TCA降低的细胞活力，并减少了ALT、AST、ALP、LDH等肝损伤标志物的释放，同时抑制了IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1等炎症细胞因子的分泌。

**3.2 网络药理学鉴定DHM抗CLI的候选靶点**
通过多数据库预测，获得547个DHM靶点和1420个CLI相关基因，交集得到145个共享靶点。PPI网络拓扑分析识别出AKT1、SRC、STAT3、MMP9和ESR1为枢纽基因，且在不同置信度阈值下结果一致。

**3.3 富集分析揭示炎症、凋亡和STAT3相关通路**
GO和KEGG分析显示共享靶点富集于炎症反应、氧化应激、凋亡、JAK-STAT信号通路、TNF信号通路和胆汁分泌通路。GSEA证实了JAK/STAT信号轴的显著参与。

**3.4 分子对接支持DHM与枢纽蛋白的潜在结合**
DHM与STAT3的结合能为-8.0 kcal/mol（结合于SH2结构域），与SRC为-8.5 kcal/mol，与MMP9和ESR1均为-7.7 kcal/mol，与AKT1为-6.7 kcal/mol，提示良好的结合亲和力。

**3.5 DHM抑制TCA处理的肝细胞凋亡和STAT3/NF-κB信号**
体外实验中，DHM和UDCA均部分逆转了TCA诱导的BAX、STAT3、MMP9、SRC上调及BCL2下调，减少了细胞凋亡率（流式细胞术），并降低了cleaved-PARP、cleaved-caspase 3、Bax蛋白水平，增加了Bcl-2水平。DHM抑制了JAK2和STAT3的磷酸化，以及p65和IκBα的磷酸化，减少了p65核转位。此外，DHM部分调节了胆汁酸稳态相关分子（FXR、SHP、BSEP）及下游基因（CYP7A1、CYP8B1、ABCB11等）的异常表达。

**3.6 DHM改善ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤**
在体内，DHM（40、80、160 mg/kg）剂量依赖性地降低了ANIT升高的肝重/体重比、血清ALT、AST、ALP、TBA水平，减轻了肝脏坏死、炎症浸润和结构破坏（H&E染色）。DHM抑制了血清炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1），恢复了抗氧化酶（CAT、GSH、SOD）活性，降低了MDA水平。DHM还降低了胆管反应标志物（Krt19、Sox9、Epcam、Krt7）的mRNA表达。

**3.7 DHM在体内抑制肝脏凋亡和JAK2/STAT3/NF-κB信号**
Western blot显示，DHM降低了ANIT诱导的cleaved-PARP、cleaved-caspase 3、Bax水平，增加了Bcl-2水平，抑制了JAK2和STAT3的磷酸化，以及p65和IκBα的磷酸化，并减少了p65核转位。qRT-PCR证实DHM部分逆转了凋亡、氧化应激和炎症相关基因的异常表达。

**3.8 药理学调控STAT3信号支持其在DHM介导的肝保护中的作用**
在TCA处理的HepaRG细胞中，AG490（JAK2/STAT3抑制剂）模拟了DHM的抗凋亡和抗炎作用，且与DHM联用无显著叠加效应。IL-6（STAT3激活剂）增强了TCA诱导的凋亡和NF-κB激活，并部分削弱了DHM的保护作用，表现为DHM无法完全抑制IL-6加剧的JAK2/STAT3磷酸化和下游凋亡蛋白变化。

**讨论与结论**
讨论部分指出，胆汁酸积累是CLI的核心特征，DHM通过抗炎、抗氧化和抗凋亡作用发挥保护。TCA暴露导致肝细胞损伤和胆汁酸稳态相关分子紊乱，而DHM部分调节了这些变化，但需谨慎解释，因其可能为细胞损伤的继发效应而非直接FXR激动活性。网络药理学和分子对接为STAT3相关信号提供了合理预测，实验验证支持JAK2/STAT3-NF-κB轴在DHM保护中的功能参与。药理学干预实验（AG490和IL-6）进一步证实了STAT3信号的关键作用。此外，DHM减轻了ANIT诱导的胆管反应转录变化。局限性包括：直接靶点未经验证、缺乏遗传学操作、胆汁酸谱和转运体功能分析未进行、未设置高剂量DHM单独组和UDCA体内比较。结论：DHM通过抑制JAK2/STAT3相关NF-κB信号，减轻肝细胞损伤、炎症、氧化应激和凋亡，从而保护TCA诱导的肝细胞损伤和ANIT诱导的CLI，并部分调节胆汁酸稳态和胆管反应标志物。