《International Immunopharmacology》：GALNT6-mediated O-glycosylation on PTGS2 regulates microglia inflammation and ferroptosis following intracerebral hemorrhage
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摘要脑出血是一种常见的中风类型，其死亡率和致残率都很高。多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶-6（GALNT6）能够催化O-半乳糖NAc糖基化反应，与多种疾病的发病有关。然而，GALNT6在脑出血发病机制中的作用至今仍不清楚。因此，本研究阐明了GALNT6在脑出血发病机制中的作用，并探讨了
摘要
脑出血是一种常见的中风类型，其死亡率和致残率都很高。多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶-6（GALNT6）能够催化O-半乳糖NAc糖基化反应，与多种疾病的发病有关。然而，GALNT6在脑出血发病机制中的作用至今仍不清楚。因此，本研究阐明了GALNT6在脑出血发病机制中的作用，并探讨了可能的潜在机制。通过使用胶原酶在小鼠体内建立脑出血模型；同时利用缺氧缺糖联合血红素处理BV2小胶质细胞来构建体外脑出血模型。通过神经功能缺陷评分和莫里斯水迷宫试验评估神经功能障碍。分别采用免疫荧光法和二氢乙二胺染色法检测脑出血模型小鼠中CD86、CD206及Iba1的表达情况以及活性氧的产生量。使用细胞计数Kit-8方法检测细胞存活率。通过流式细胞术检测CD86+CD11b+、CD206+CD11b+细胞比例以及脂质活性氧水平。通过酶联免疫吸附试验检测与炎症相关的因子分泌水平。采用共免疫沉淀分析方法检测GALNT6与PTGS2的结合情况。通过凝集素拉下试验确定PTGS2的O-半乳糖NAc糖基化状态。利用ChIP-PCR和报告基因检测方法分析HIF-1α与Galnt6启动子的结合情况。研究发现脑出血小鼠体内GALNT6表达升高，而敲低Galnt6可减轻脑出血小鼠的空间记忆障碍、炎症反应、氧化应激及铁死亡现象。此外，敲低Galnt6还能抑制BV2小胶质细胞在缺氧缺糖处理下的炎症反应和铁死亡，而其过表达则会通过诱导铁死亡促使BV2小胶质细胞向M1型极化并引发炎症。进一步研究显示，GALNT6可促进PTGS2的O-半乳糖NAc糖基化，敲低Galnt6可通过抑制PTGS2的功能来减少BV2小胶质细胞在缺氧缺糖处理下的M1型极化、炎症反应及铁死亡。同时，HIF-1α能够与Galnt6启动子结合并促进Galnt6的转录。HIF-1α-GALNT6-PTGS2轴调控着BV2小胶质细胞的极化、炎症反应及铁死亡过程。综上，Galnt6受HIF-1α的转录调控，在脑出血中表现出高表达水平。GALNT6可诱导PTGS2的O-半乳糖NAc糖基化，敲低Galnt6可通过抑制PTGS2的功能来减轻脑出血中的炎症反应和铁死亡，因此GALNT6可能是治疗脑出血的潜在靶点。
引言
脑出血是一种急性脑血管疾病[1]、[2]，也是第二常见的中风类型，约占所有中风病例的10%–15%[3]。脑出血的特征是脑血管非外伤性破裂，导致血液积聚在脑组织中，进而引发局部神经功能缺损[1]。脑出血造成的损伤可分为两个阶段：一是持续出血引发的初级损伤，二是血肿形成导致的继发性脑损伤，这些都会引起神经元死亡、神经炎症等多种复杂的生理变化[1]、[4]，而继发性脑损伤正是脑出血后出现功能障碍的主要原因[1]、[5]。尽管外科手术和化疗技术有所进步，但目前仍没有有效的治疗方法能够改善脑出血患者的预后[4]、[6]，这类疾病的1年死亡率和5年死亡率分别为46%和29%[7]、[8]、[9]。脑出血患者的功能独立性较低，仅有12%–39%的幸存者能够独立生活[7]、[8]、[9]，因此亟需阐明脑出血的发病机制并探索有效的治疗策略。
铁死亡是一种新型的铁依赖性细胞死亡方式，其特征为大量铁元素积累和脂质过氧化[10]。人们普遍认为，发现铁死亡为各种疾病的发病机制、发展过程及治疗手段的研究提供了新的思路[11]。先前的研究已表明脑出血损伤可诱发铁死亡，例如Li等人发现脑出血后会释放大量铁元素，而这些铁元素在脑组织中的积累是血肿周围细胞死亡的重要原因[12]；此外，作为铁死亡抑制剂的铁死亡抑制剂1能够显著改善脑出血引起的神经功能缺陷和记忆障碍[13]，因此针对铁死亡开展干预可能是一种有效的脑出血治疗策略。
糖基化是一种种类极为多样的翻译后修饰反应，其起始阶段是在内质网中首先发生糖基转移，随后糖基会进入高尔基体，在那里会逐步添加多种糖链以促进糖链的成熟[14]、[15]。人体内存在多种类型的糖基化反应，主要包括与天冬酰胺相连的N-糖基化、与丝氨酸和苏氨酸相连的O-糖基化，以及与色氨酸相连的C-糖基化，这些糖基化反应都会带来明显的结构变化[14]、[16]。由于糖基的添加会改变多肽的生物物理性质，因此糖基化对蛋白质的功能和折叠至关重要[17]。近期有研究指出糖基化与疾病进展存在关联[18]、[19]，Zhu等人发现ENO1蛋白的糖基化水平会影响结直肠癌的免疫逃逸现象[18]，Memarian等人则表明血浆蛋白的N-糖基化与2型糖尿病相关的心血管疾病、肾病及视网膜病变有关[19]。值得注意的是，糖基化在脑出血的发病机制中也起着关键作用[20]、[21]，Ning等人发现黏液型O-糖基化（即O-半乳糖NAc糖基化）修饰可抑制脑出血细胞模型中的神经元凋亡[20]，He等人也证实O-半乳糖NAc糖基化在抑制脑出血后的炎症反应、维护血脑屏障完整性以及减轻水肿方面发挥着重要作用[21]，不过蛋白质糖基化在脑出血发病机制中的具体作用机制仍有待进一步研究。
多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶-6（GALNT6）属于N-乙酰-D-半乳糖胺转移酶家族成员[22]，它主要存在于高尔基体中，能够催化O-半乳糖NAc糖基化反应[23]、[24]、[25]、[26]，因此与多种生理和病理过程密切相关[22]，例如GALNT6可加速乳腺癌细胞的肿瘤发生和转移进程[22]，在胰腺导管腺癌细胞中则会促进炎症反应和焦亡现象的发生[26]，此外在结直肠癌细胞的缺氧环境中，活性升高的GALNT6还能降低氧化应激水平[25]，不过GALNT6在脑出血发病机制中的具体功能作用及其分子机制目前尚不明确。
本研究通过检测小胶质细胞中的炎症反应和铁死亡情况，探讨了GALNT6在脑出血发病机制中的作用，同时阐明了PTGS2在T574和T578位点发生O-半乳糖NAc糖基化的潜在分子机制。此外，本研究还证明了抑制HIF-1α介导的GALNT6转录在脑出血治疗中具有潜在价值，HIF-1α-GALNT6-PTGS2轴可调控小胶质细胞中的炎症反应和铁死亡，这为寻找新的脑出血治疗靶点提供了可能。
章节节选
脑出血小鼠模型的建立
本研究涉及的动物实验已获得医院实验动物福利伦理委员会的批准，并严格按照美国国立卫生研究院关于实验室动物饲养与使用的指南开展。实验用雄性C57BL/6小鼠（年龄8–10周，体重25–30克）购自北京维泰尔实验动物技术有限公司，实验开始前通过计算机生成的随机序列将小鼠随机分为三组（每组6只），随后进行脑出血模型构建及慢病毒处理
敲低Galnt6可减轻脑出血小鼠的空间记忆障碍和炎症反应
为明确GALNT6在脑出血发病机制中的作用，首先建立了脑出血小鼠模型，并给小鼠注射shGalnt6基因序列。实验结果显示，脑出血小鼠的神经功能缺陷评分明显高于对照组小鼠，而沉默Galnt6基因后该评分有所下降（P＜0.001，见图1A）。此外，通过莫里斯水迷宫试验发现，脑出血小鼠在第三天和第四天的迷宫逃脱潜伏期明显长于对照组小鼠的第一天和第二天，但沉默Galnt6基因后这一情况得到了改善（P
讨论
脑出血是一种常见且致死率、致残率都很高的中风类型[1]、[2]、[3]、[7]、[8]、[9]，目前现有的治疗手段效果不佳，这凸显出寻找新的治疗策略和靶点的迫切需求[4]、[6]。GALNT6能够催化O-半乳糖NAc糖基化反应，与多种疾病的发病机制存在关联[22]、[23]、[24]、[25]、[26]，不过其在脑出血发病机制中的作用目前仍缺乏足够研究，因此开展了本研究
作者贡献声明
F.C.和S.Y.负责该研究的构思与设计工作，C.H.和X.H.承担了实验操作（包括动物模型构建和分子生物学检测）并撰写了初稿，F.Z.、P.W.和X.X.负责数据收集及统计分析工作，H.X.和S.J.提供了技术支持并协助进行了文献检索，F.C.和S.Y.对 manuscript进行了审阅和修改，所有作者都阅读并通过了最终版本的manuscript。
伦理审批说明
本研究中的所有动物实验及相关操作均严格遵循实验室动物饲养与使用规范，且已获得遵义医科大学动物实验伦理委员会的批准。
资金支持
本研究得到国家自然科学基金的资助（项目编号：82260260、82260247）。
利益冲突声明
所有作者声明不存在任何可能影响本论文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
Chong Han|Xiaohong Hou|Fuan Zhang|Peirui Wang|Xiangping Xia|Hua Xiao|Song Jiao|Fang Cao|Shengtao Yao
中国贵州省遵义市563000，遵义医科大学附属医院神经外科
