综述：γ类碳酸酐酶：连接早期地球代谢、微生物生理学与现代生物化学创新的古老酶类

《International Journal of Biological Macromolecules》：γ-Class carbonic anhydrases: Ancient enzymes at the interface of early earth metabolism, microbial physiology, and modern biochemical innovation

　　摘要：γ类碳酸酐酶是原核生物中最为古老且结构独特的CO?水合酶，其特点是金属离子结合灵活性高，催化机制适合古生代缺氧、富含Fe2+的环境。这类酶在古菌谱系中广泛存在，尤其是在产甲烷菌中，这一现象支持了γ类碳酸酐酶属于较早分化的碳酐酶分支的假说。目前已知的γ类碳酸酐酶主要有两种类型：Cam型依赖典型的三组组氨酸构成的金属离子结合结构以及由谷氨酸介导的质子转运机制；而CamH亚型则缺乏这种酸性残基，表明其具有不同的质子转移机制。在多种人类病原体中，包括霍乱弧菌，γ类碳酸酐酶仍发挥着维持细胞内CO?/HCO??平衡、调节pH值以及控制毒力等重要生理功能。近期研究显示，某些γ类碳酸酐酶还可能具有类似硅酸酶的活性，这说明该酶类具有潜在的催化可塑性，有助于拓展其功能范围，并可能揭示碳代谢与富含矿物质的环境之间的关联。除了在进化上的重要性外，γ类碳酸酐酶还是极具价值的生物医学靶点——由于它们在脊椎动物中不存在，这为开发选择性抗菌药物提供了良好的机会。在生物技术领域，γ类碳酸酐酶的耐热性和对金属离子的耐受性使其可应用于工业二氧化碳捕集、合成生物学以及矿物生物加工等领域。本综述总结了目前关于γ类碳酸酐酶的结构、机制及功能方面的研究进展，指出了尚未解决的关键问题，尤其是催化特异性以及CamH亚型的相关疑问，并提出了未来研究方向，以进一步阐明其在酶类进化及现代微生物生理功能中的作用。

引言：碳酸酐酶是一类结构多样的金属酶超家族，能够催化二氧化碳可逆地水合生成碳酸氢盐和质子，这一反应对于代谢调控、酸碱平衡以及整个生物圈中的碳循环至关重要[1][2][3]。尽管催化同一反应，碳酸酐酶却分为八个进化上不同的类别，即α、β、γ、δ、ζ、η、θ和ι类，各类酶具有不同的折叠结构、催化机制及金属离子依赖性，这反映了在不同环境条件下为实现CO?/HCO??的快速转换而独立演化出的不同解决方案[4][5][6][7]。在这些类别中，γ类碳酸酐酶以其三聚体的左旋平行β螺旋结构为特征，主要存在于古菌和细菌中，尤其是那些生活在类似早期地球环境中的嗜热及厌氧微生物中[7][8][9][10]。这种分布特征加上其结构特点和金属离子结合的灵活性，使得人们认为γ类碳酸酐酶很可能是最早分化的碳酸酐酶分支，即“原始碳酸酐酶”，早于在各种原核生物和真核生物中广泛存在的β类和α类碳酸酐酶[3]。

典型的γ类碳酸酐酶是来自热甲烷菌的Cam酶，它以三聚体形式存在，活性位点位于单体界面处，通过保守的组氨酸三联体与金属离子（通常是Fe2+、Zn2+或Co2+）结合，从而形成金属结合的氢氧化物，作为CO?水合反应的亲核试剂[2][7][8][10][11][12][13][14][15]。使用Fe2+作为金属离子与古生代的地球化学条件相符，因为当时环境中还原态的铁含量很高[16]。现代γ类碳酸酐酶则依靠谷氨酸89作为质子转运载体，并借助有序的水网络进行质子传递，这种催化设计适合无氧、高温且富含矿物质的环境，这类环境更有利于简单、以金属为中心的酶促反应机制的发挥[15][17][18]。相比其他类别的碳酸酐酶，γ类碳酸酐酶的催化口袋最小，底物特异性也较低，而β类和α类碳酸酐酶由于活性位点的扩展和构象多样性，具有更广泛的催化功能[8][9][19][20][21][22]。

从生理功能上看，无论在细菌还是古菌中，γ类碳酸酐酶都在维持细胞内CO?/HCO??平衡、调节细胞质pH值以及适应不断变化的二氧化碳浓度方面起着核心作用[23][24]。通过删除碳酸酐酶基因的研究发现，大肠杆菌在正常二氧化碳浓度下无法生长，而提高二氧化碳浓度则能促进其生长，这充分体现了碳酸酐酶在维持碳平衡中的关键作用[24][25]。在致病细菌中，γ类碳酸酐酶参与决定毒力、帮助细菌耐受酸性环境、调控依赖碳酸氢盐的基因表达以及协助细菌在宿主体内定植，这一现象在猪布鲁氏菌、霍乱弧菌以及其他临床相关病原体如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌中都有体现，抑制这些细菌的碳酸酐酶功能会降低其存活率或影响其毒力相关途径的功能[3][20][26]。最近的研究还将γ类碳酸酐酶的功能范围扩展到了二氧化碳水合之外。有一项专利指出，来自热甲烷菌、巴克尔氏甲烷菌、耐盐芽孢杆菌和克劳斯芽孢杆菌的γ类碳酸酐酶具有硅酸酶活性，能够在生理条件下转化无定形和结晶态的二氧化硅[27]。此前仅在α类碳酸酐酶中发现过这种催化能力[28]，这一发现表明γ类碳酸酐酶与富含二氧化硅的热液系统之间存在进化联系，也暗示了原始的γ类碳酸酐酶可能与支持原始代谢活动的矿物质微环境存在相互作用。无论在古菌还是细菌中都存在硅酸酶活性，这一事实可能说明该功能具有深远的进化起源，同时也拓展了碳酸酐酶学的研究范畴[29]。

除了在进化研究中的重要性外，γ类碳酸酐酶在生物医学和生物技术领域也日益展现出应用价值[30]。由于人类及多种病原体中均不存在这类酶，因此它们成为了极具潜力的抗菌药物靶点[3][20][30]。抑制剂研究显示，传统的磺胺类药物，如乙酰唑胺、甲唑胺和乙氧唑胺，以及新近开发的氨基磺酰亚胺衍生物，都能有效抑制耐药病原体（如耐万古霉素的肠球菌和淋病奈瑟菌）中的γ类碳酸酐酶，这凸显了它们的治疗潜力[3][20][30][31]。在生物技术领域，γ类碳酸酐酶的耐热性和对金属离子的耐受性使其可应用于二氧化碳捕集、合成生物学以及矿物生物加工等方面[32][33][34]。总体而言，γ类碳酸酐酶为研究早期代谢化学、现代微生物生理功能以及新兴应用之间的相互关系提供了重要框架。本综述综合了结构、进化、机制及功能等方面的研究进展，总结了当前已知知识，指出了关键研究空白，并提出了未来的研究方向。

γ类碳酸酐酶的结构特征：γ类碳酸酐酶具有典型的三聚体结构以及紧凑的蛋白质折叠方式，这一特征将它们与其他所有碳酸酐酶家族区分开来。其中研究最为透彻的代表是来自热甲烷菌的Cam酶，它被视作该酶类的典型模型[13][14][15][35][36]。其单体采用左旋平行β螺旋结构，这种折叠方式具有较高的内在稳定性，常见于古菌和嗜热蛋白中。如图1所示，三个单体组装成对称的三聚体结构。

为了将γ类碳酸酐酶置于定量结构分析框架之下，我们对蛋白质数据银行中的相关数据进行了系统梳理。蛋白质数据银行是一个开放获取的数据库，存储着通过实验测定得到的宏观分子结构信息。检索工作是在2026年3月进行的，我们通过基于序列的信息查询以及基于注释的查询相结合的方式，其中还包括以热甲烷菌的典型γ类碳酸酐酶（PDB编号：1THJ）为检索依据，最终整理出了一组不含重复数据的古菌和细菌代表物种的数据库[41]。

γ类碳酸酐酶的催化机制与金属离子依赖性：γ类碳酸酐酶通过一种跨整个碳酸酐酶超家族都存在的、但经过适应性调整以适应γ类结构特性的金属离子依赖型机制，来催化二氧化碳的可逆水合反应生成碳酸氢盐[9][47][48]。催化循环始于与二价金属离子结合的水分子的活化，这一反应通常由与二价金属离子（通常是Fe2+，也可能是Zn2+或Co2+）结合的水分子被激活而启动。金属离子的结合会降低该水分子的pKa值。

γ类碳酸酐酶的分布、功能多样性及新发现的活性：γ类碳酸酐酶在原核生物的不同谱系中呈现出特定的分布模式，这一模式为研究它们的进化起源和生理功能提供了重要线索。比较基因组分析表明，细菌、古菌和真核生物中的大多数γ类碳酸酐酶同源物都属于CamH亚群，而真正的Cam型酶则相对较少，主要存在于热甲烷菌属以及少数细菌物种中[12]。这种不均衡的系统发育分布进一步强化了γ类碳酸酐酶作为原始碳酸酐酶分支的观点。

γ类碳酸酐酶的进化地位：由于γ类碳酸酐酶具有多种表明其具有原始生化起源的分子特征，因此其进化定位一直备受关注。比较系统发育分析表明，γ类碳酸酐酶很可能属于较早分化的酶类分支。在关于细菌碳酸酐酶的综合性研究中发现，γ类碳酸酐酶在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中形成了一个系统发育上连贯的群体，而α类碳酸酐酶则……

γ类碳酸酐酶、LUCA与早期地球的生物能量学：如果假设γ类碳酸酐酶属于较早分化的碳酸酐酶分支，那么它们的生化特性和生态分布为理解它们在细胞进化早期阶段可能所扮演的角色提供了有力依据，尤其是与LUCA所处的环境和代谢条件相关的方面。本节探讨如何将γ类碳酸酐酶的特性与LUCA时代的生物能量学背景相联系。与这一假设一致的是，γ类碳酸酐酶表现出相应的生化特性……

现代原核生物中γ类碳酸酐酶的生理功能：在细菌和古菌中，γ类碳酸酐酶发挥着至关重要的生理作用，它们支撑着那些依赖于细胞内二氧化碳和碳酸氢盐平衡的代谢途径。这类酶的存在通常与溶解无机碳物种之间的平衡不稳定或处于限制状态的环境密切相关[48]。在许多细菌中，γ类碳酸酐酶参与驱动依赖碳酸氢盐的羧化反应，这些反应对于氨基酸、核苷酸和脂肪酸的生物合成至关重要，有助于在二氧化碳浓度波动的情况下维持细胞的代谢平衡。

γ类碳酸酐酶的催化特异性及可能的硅酸酶活性：其结构基础、环境因素及实验局限：另有研究表明，某些γ类碳酸酐酶具有硅酸酶活性，这一发现为γ类碳酸酐酶的功能多样性带来了新的视角。据美国专利US8822188B2的描述，来自热甲烷菌属的一些物种（如热甲烷菌和巴克尔氏甲烷菌）以及某些芽孢杆菌菌株能够在温和条件下催化二氧化硅的转化[27]。这些γ类碳酸酐酶被认为具有类似硅酸酶的活性，能够在水环境中实现二氧化硅的转化。不过，这一结论目前还缺乏更多直接证据支持。

γ类、α类、β类和ι类碳酸酐酶的结构比较：在整个碳酸酐酶超家族中观察到的结构多样性，反映出该家族的进化历程是以反复的创新而非线性演化为主，因此形成了多个具有相同催化功能但分子结构和催化机制存在显著差异的酶类分支。在γ类碳酸酐酶中，催化作用依赖于相邻亚基所提供的特定残基，这些残基共同构成一个界面活性位点，该位点对底物进入具有严格的几何限制，这一点与其他类型的碳酸酐酶有所不同。

γ类碳酸酐酶的生物医学与生物技术应用价值：随着人们对γ类碳酸酐酶的功能特性、结构独特性以及生态分布的了解不断深入，其在生物医学和技术领域的应用前景也越来越受到重视。由于人类体内不存在这类酶，而它们在细菌和古菌中广泛存在，这为开发具有选择性的治疗药物提供了独特的机会。同时，它们出色的生物化学稳定性和对金属离子的耐受性，也为在工业生物催化和环境处理领域开展创新应用奠定了基础。

当前尚未解决的问题及未来研究方向：尽管在γ类碳酸酐酶的生物化学和结构特性研究方面已经取得了显著进展，但关于它们的生物学功能、进化历程以及催化行为仍有许多方面亟待深入研究。为推动该领域的发展，还需要解决与γ类碳酸酐酶相关的若干关键问题：首先，关于其原始功能谱系的问题——虽然目前已明确知道它们在二氧化碳水合反应中的功能，但尚不清楚这是否就是它们在最初阶段的唯一功能。原始的“原始碳酸酐酶”是否还具有其他功能？

结论：γ类碳酸酐酶属于碳酸酐酶超家族中古老且结构独特的一个分支，它具有紧凑的蛋白质折叠结构、金属离子结合的灵活性，以及与早期起源相关的催化机制，这一起源时间早于β类和α类碳酸酐酶的分化。它们的三聚体结构、界面活性位点以及依靠溶剂介导的质子转移机制，共同构成了一个符合早期原核生物进化过程中地球化学条件的最小化催化系统。在当今……

致谢：Luigi F. Di Costanzo：负责文章撰写与编辑、可视化处理、形式分析、数据整理以及概念构思工作；Clemente Capasso：负责文章撰写与编辑、初稿编写、项目监督与管理以及概念构思工作；Claudiu T. Supuran：负责文章撰写与编辑、资源协调以及概念构思工作。

利益冲突声明：作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

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