《International Journal of Biological Macromolecules》：High-cell-density fermentation of Komagataella phaffii enables the overproduction of a novel, broad-substrate endoglucanase, WcEG394 from Fuling (Wolfiporia cocos), for lignocellulose biorefining
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摘要此前对以滤纸为唯一碳源培养的W. cocos“香泾28”菌株的转录组分析发现，其中存在一种含量极高的内切葡聚糖酶WcEG394，这说明该酶在高效降解纤维素过程中起着重要作用。为探究该酶的结构与功能基础并评估其应用潜力，我们采用了生物信息学分析、高细胞密度发酵以及酶学特性检测相
摘要
此前对以滤纸为唯一碳源培养的W. cocos“香泾28”菌株的转录组分析发现，其中存在一种含量极高的内切葡聚糖酶WcEG394，这说明该酶在高效降解纤维素过程中起着重要作用。为探究该酶的结构与功能基础并评估其应用潜力，我们采用了生物信息学分析、高细胞密度发酵以及酶学特性检测相结合的综合研究方法。序列分析及结构建模将WcEG394归类为糖苷水解酶家族5（GH5），并确定了其典型的(α/β)8 TIM桶状结构。在Komagataella phaffii中开展的高细胞密度分批发酵实验中，成功获得了重组WcEG394，其产量达23克/升。该粗酶的羧甲基纤维素酶活性为2217.6 U/毫升，滤纸降解活性为110.4 U/毫升。该酶在pH 4.0、50℃条件下活性最佳，在酸性及中温环境下仍能保持稳定性，同时对多种金属离子具有较好的耐受性。以羧甲基纤维素作为底物时，该酶的Km值和比活性分别为2.8毫克/毫升和113.7 U/毫克。重组WcEG394能够高效降解羧甲基纤维素、微晶纤维素和滤纸，同时对木聚糖、果胶、几丁质、琼脂糖以及玉米芯、甘蔗渣等农业废弃物也表现出广泛的底物特异性。扫描电子显微镜观察进一步证实，经rWcEG394处理后，滤纸和棉纤维的表面形态更加光滑，同时结构完整性得以保留。综上所述，rWcEG394具备作为高效生物催化剂用于大规模纤维素生物质加工的潜力。
引言
内切葡聚糖酶在纤维素糖化过程中发挥着关键作用[1]。工业上生产的纤维素酶主要依赖于Trichoderma reesei这类真菌，它们能够分泌出大量对底物亲和力强的胞外酶[2]、[3]。真菌来源的内切葡聚糖酶大多属于糖苷水解酶家族GH5、GH7和GH12，可通过 submerged或固态发酵方式生产[4]、[5]。不过，曲霉属真菌存在一个突出问题：其分泌的酶中以纤维二糖水解酶为主，同时还含有大量非目标蛋白，这不仅增加了纯化难度，还提升了生产成本[6]、[7]。虽然基因工程技术可以提高内切葡聚糖酶的产量，但由于无法有效去除杂质蛋白，目前所获得的酶制品往往难以满足某些特殊工业应用对纯度的要求[8]。
正是由于纯度和产量方面的长期限制，人们开始寻求从其他真菌来源中获取活性更高、更易于纯化的内切葡聚糖酶。在这方面，遗传分析技术的快速发展使得人们能够识别并研究众多结构新颖、功能多样的纤维素酶基因[9]、[10]。Wolfiporia cocos是一种传统中药真菌，也是一种可食用的大型真菌，已有研究表明它具有很强的木质纤维素降解能力。尽管这类真菌所含的CAZyme数量相比其他腐木真菌要少，但它们很可能具备极高的活性和丰富的功能多样性[11]、[12]。在我们之前对W. cocos的转录组研究中，共发现了71个与纤维素水解相关的CAZyme基因[10]。后续的生物信息学分析又发现了五种潜在的分泌型内切纤维素酶，其中只有两种内切葡聚糖酶的表达水平较高。其中WcEG394的分子量最大，其编码序列长度为1239 bp，包含一段19个氨基酸长的信号肽。在W. cocos降解纤维素的关键阶段，这种酶的转录水平会升高数百倍。初步的生物信息学分析表明，该酶对纤维素、地衣以及谷物中的β-D-葡聚糖中的(1 → 4)-β-D-葡萄糖苷键具有很强的水解活性，这凸显了它在分解纤维素及相关多糖过程中的核心作用。值得注意的是，WcEG394的某些特征与其他大多数内切葡聚糖酶不同，后者的水解活性通常仅限于羧甲基纤维素。分子对接分析进一步表明，该酶对多种小分子寡糖都具有较高的催化效率。正是由于具备降解多种复杂碳水化合物的能力，WcEG394有望被应用于实际场景并得到进一步开发。
然而，直接利用W. cocos菌丝体生产纤维素酶面临着两个主要障碍：其一，与Trichoderma属等工业用真菌相比，该真菌自身分泌的纤维素分解酶含量较低；其二，实现大规模高效培养该菌丝体也存在很大困难。因此，使用这种真菌进行传统发酵在经济上并不划算。这一局限性促使人们将研究重点转向重组蛋白表达系统。值得一提的是，真核宿主Komagataella phaffii（原名Pichia pastoris）已被证明是更为理想的表达平台[13]、[14]。该平台能够高效表达异源纤维素酶，且内源性蛋白背景极低，从而大大简化了后续的纯化流程。由于该系统支持高细胞密度发酵，如今已可实现多种纤维素酶的高效工业化生产。一些典型的例子包括来自Thermothielavioides terrestris的耐热内切葡聚糖酶TtCel45A，其产量可达15克/升，酶活性为9640 U/毫升；来自T. reesei的耐热酸性内切葡聚糖酶II，在1%（体积比）甲醇诱导处理72小时后，其诱导效率很高，羧甲基纤维素酶活性可达2358.8 U/毫升；还有来自Aspergillus fumigatus的AfCel12A以及来自Thermomyces aurantiacus的TaCel5A，这两种酶在高密度发酵系统中的重组表达量分别约为1.9克/升和0.2克/升[15]、[16]、[17]。
借助高效的K. phaffii表达系统，我们成功制备了重组WcEG394，并对其底物特异性、动力学特性以及最适反应条件进行了研究。实验结果表明，该酶能够有效降解多种农业废弃物以及碳水化合物聚合物，这为其在生物能源、纺织业、造纸业以及木质纤维素废物的生物处理领域中的应用奠定了基础。
章节要点
材料
逆转录（RT）-聚合酶链反应（PCR）试剂盒、限制性内切酶以及其他相关酶类均购自北京贝泰克生物技术有限公司。牛肠碱性磷酸酶则从北京泰卡拉生物技术公司获得。野生型表达宿主K. phaffii X33以及带有AOX1启动子和α因子分泌信号的pPICZαA表达载体，均来自上海赛默飞世尔科技公司。此外还使用了Luria-Bertani Zeocin培养基。
生物信息学分析
通过RT-PCR扩增得到的目标片段大小与预测值一致。经过测序的1242 bp片段包含了413个氨基酸，其中N端有19个氨基酸长的信号肽，后续为394个氨基酸长的成熟蛋白（见图S1）。WcEG394蛋白的理论分子量为42 kDa。通过NCBI BLASTN分析，共找到了七个同源基因序列。其中WcEG394与Irpex lacteus的Cel5B（登录号：OQ909525.1）以及Penicillium cataractarum的相似度最高。
结论
WcEG394是一种属于GH5家族的内切葡聚糖酶，具有典型的(α/β)8 TIM桶状结构。在高细胞密度K. phaffii发酵体系中，该酶的分泌产量可达23克/升，这一数值超过了此前报道的重组内切葡聚糖酶的最高产量15.8克/升。发酵上清液中的羧甲基纤维素酶活性为2217.6 U/毫升，滤纸降解酶活性为110.4 U/毫升。该酶在pH 4.0、50℃条件下活性最佳，同时具有较强的耐酸能力、较高的盐耐受性以及广泛的底物特异性。
CRediT作者贡献说明
李洪波：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿，研究指导，资源提供，实验开展，资金筹措，正式分析，概念构思。颜文玲：论文撰写——初稿，结果验证，实验开展，正式分析。唐凌志：论文撰写——初稿，结果验证，实验开展，正式分析。万子琳：结果验证，实验开展，正式分析。苏静静：结果验证，实验开展，正式分析。张鸿瑞：结果验证，实验开展，正式分析。
利益冲突声明
所有作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关联关系。
致谢
本研究的部分经费由国家自然科学基金（项目编号：32360700）、湖南省教育厅科学研究基金（项目编号：24A0763）、湖南省自然科学基金（项目编号：2026JJ80515）以及湖南医科大学博士科研启动基金提供支持。
Hongbo Li|Wenling Yan|Lingzhi Tang|Zilin Wan|Jingjing Su|Hongrui Zhang
