甜菜碱和胆碱多元醇基深度共晶溶剂对纤维素酶稳定性和活性的调控

《International Journal of Biological Macromolecules》：Modulation of cellulase stability and activity by betaine- and choline-polyol based deep eutectic solvents

　　

摘要

化石燃料的枯竭以及气候变化带来的担忧，使得人们开始关注木质纤维素生物质作为生产生物燃料的可持续原料。木质纤维素生物质中的主要生物大分子成分纤维素，可通过酶解高效转化为可发酵糖类；然而，传统的预处理方法能耗高且对环境不利。深度共晶溶剂作为一种绿色替代方案，逐渐被用于生物质加工领域。若要实现一体化单锅生物转化，深度共晶溶剂需与纤维素酶相兼容。本研究通过实验和计算方法，评估了14种不同深度共晶溶剂对纤维素酶稳定性和活性的影响。结果表明，以氯化胆碱和多元醇为基料的深度共晶溶剂能显著提升纤维素酶的稳定性和催化活性，显示出其作为可持续单锅木质纤维素生物质转化用纤维素酶兼容介质的潜力。荧光光谱分析结合分子动力学模拟显示，纤维素酶在保持其溶剂化外壳的同时，会呈现紧凑稳定的构象。这些发现表明，精心选择深度共晶溶剂对于开发高效的基于深度共晶溶剂的生物质转化工艺至关重要。

引言

近年来，化石燃料的日益枯竭以及全球变暖问题加剧，促使人们更多研究如何利用生物质，尤其是最丰富的可再生资源——木质纤维素生物质，作为生产生物燃料的可持续、环保型原料，以此为当前的能源需求和环境问题提供解决方案[1]。木质纤维素材料主要由三种聚合物组成：纤维素、半纤维素和木质素[2]。其中纤维素是木质纤维素生物质的主要成分，其含量因原料不同而介于35%到50%之间[3]、[4]。与化学处理方法相比，利用纤维素酶对纤维素进行酶解具有产量更高、选择性更强、能耗更低且操作条件更温和等优点，因此越来越受到重视[5]。这一过程主要包括两个步骤：一是对木质纤维素生物质进行预处理，打破其复杂结构，使其更易于后续的酶解处理；二是将各类成分酶解为简单糖类[4]、[6]。不过，相比多步骤工艺，无需在预处理后再进行额外耗能步骤的一锅法处理更为经济[7]。

近期，源自天然物质的深度共晶溶剂逐渐成为多种工业应用领域的绿色替代溶剂[3]、[8]、[9]。这类溶剂制备简便，成本低于离子液体，且对环境友好。通过调整其组成成分的种类及比例，可以调控深度共晶溶剂的性质。正因如此，它们在生物催化、造纸工业以及提取工艺等诸多领域都引起了广泛关注[9]、[10]、[11]、[12]。研究人员还发现，深度共晶溶剂能够溶解木质纤维素生物质，凭借其实用、环保且经济的优势，有望取代传统的物理化学预处理方法[3]。要成功应用一锅法工艺，了解深度共晶溶剂如何影响纤维素酶的稳定性和活性至关重要。但目前大多数研究主要集中在预处理阶段，往往忽视了后续的酶解步骤，仅有少数研究探讨过深度共晶溶剂对纤维素酶活性和稳定性的影响。

Jamal及其同事的研究表明，在含有10%乙二醇和甘油基深度共晶溶剂的条件下，纤维素酶仍能保持90%的活性，同时葡萄糖产量提高，能耗降低[7]。另一项研究则考察了由甜菜碱、氯化胆碱和多元醇组成的七种天然深度共晶溶剂，发现以多元醇为基料的深度共晶溶剂能够提升纤维素酶的稳定性[13]。Huang等人研究了四种深度共晶溶剂对纤维素酶活性和稳定性的影响，结果发现，在60℃以下时，这类溶剂能够保持纤维素酶的活性。值得注意的是，当存在30%（体积比）由甜菜碱和乙二醇组成的深度共晶溶剂时，它能够增加微晶纤维素的溶解度，且不会破坏其结构，从而有效提升纤维素向糖类的转化效率[1]。此外，还有研究将基于氯化胆碱：柠檬酸以及乙二醇：柠檬酸的超声辅助深度共晶溶剂应用于生物乙醇生产的预处理过程中，结果显示使用超声辅助的乙二醇：柠檬酸深度共晶溶剂体系可获得最高的产量[14]、[15]。在另一项研究中，研究人员使用含有乙二醇和甘油的氯化胆碱基深度共晶溶剂，检测了耐盐性纤维素酶体系与这类溶剂的兼容性，发现10%到20%（体积比）的此类溶剂能够同时提升酶的稳定性以及微晶纤维素的葡萄糖产出率[16]。Wang等人发现，在含有10%（体积比）氯化胆碱：1,3-丙二醇（1:2）以及5%（体积比）甜菜碱：甘油（1:2）的深度共晶溶剂环境中，纤维素酶的活性有所提升。此外，这类溶剂还能形成保护层，防止木质素在酶解过程中与酶结合，进而显著提高酶促糖化的效率[17]。Gupta及其同事的研究表明，即使在较高浓度（70%体积比）的深度共晶溶剂（即ethaline、reline和glyceline）环境中，纤维素酶依然保持稳定，且能够帮助以更低的能耗完成木质纤维素生物质向葡萄糖的一锅法转化过程[18]。

目前大多数研究都集中在深度共晶溶剂在生物质转化中的应用上，而对深度共晶溶剂与纤维素酶之间的相互作用，以及这类相互作用对纤维素酶活性影响的探讨相对较少。在上述研究中，氯化胆碱通常被用作氢键受体，而用作氢键供体的物质一般含有三个或更少的羟基。此外，这些研究大多仅采用实验方法，未借助计算模拟来深入分析深度共晶溶剂与纤维素酶之间的相互作用。近期，由于具有可再生来源，以甜菜碱为基料的深度共晶溶剂受到了越来越多的关注。不过，目前尚无系统性的研究对比使用相同氢键供体但成分不同的氯化胆碱基和甜菜碱基深度共晶溶剂的效果，尤其是那些含有三个以上羟基的氢键供体所对应的深度共晶溶剂。含有更多羟基的氢键供体的深度共晶溶剂，可能会对酶的性质产生不同的影响。现有研究普遍认为，由于具有稳定蛋白质和良好的生物相容性，以多元醇为基料的深度共晶溶剂能为酶的稳定性和活性创造更有利的环境。

鉴于关于纤维素酶与深度共晶溶剂相互作用的文献较为有限，且缺乏对不同深度共晶溶剂-纤维素酶体系的系统性比较，本研究通过实验和计算两种方法，探讨了深度共晶溶剂对纤维素酶的影响。研究中考察了由不同氢键受体（包括甜菜碱、氯化胆碱和氨基酸）以及不同氢键供体（包括含有三个以上羟基的多元醇和有机酸）构成的深度共晶溶剂，具体种类如表1所示。并对各种深度共晶溶剂体系中纤维素酶的活性和结构变化进行了系统评估。

章节节选

材料

本研究中使用的化学试剂均购自Sigma-Aldrich、ThermoScientific以及Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.，使用时未进行进一步纯化。所用试剂的具体信息如下：纯度≥98%的甜菜碱（CAS编号：107-43-7）；纯度≥98%的D-山梨醇（CAS编号：50-70-4）；纯度≥99%的木糖醇（CAS编号：87-99-0）；纯度为98%的左旋丁酸（CAS编号：123–76-2）；纯度≥99.5%的D-(+)-葡萄糖（CAS编号：50–99-7）；纯度≥99.0%的醋酸钠（CAS编号：127-09-3）；纯度为97–100.5%的亚硫酸钠（CAS编号：7681-57-4）；

深度共晶溶剂存在下纤维素酶的活性

根据现有文献，以多元醇为基料的深度共晶溶剂能够稳定并提升纤维素酶的活性[1]、[7]、[13]。本研究中，测试了在不同浓度的多种多元醇及有机酸基深度共晶溶剂存在下，纤维素酶的活性情况，浓度分别为5%、10%、25%和50%（重量百分比）。图2展示了不同深度共晶溶剂存在下纤维素酶的活性，其中黑色虚线代表25℃时纤维素酶100%的相对活性。

从图2a可以看出

结论

本研究系统地评估了以多元醇和有机酸为基料的深度共晶溶剂对纤维素酶活性及结构稳定性的影响。酶活性检测结果表明，以多元醇为基料的深度共晶溶剂，尤其是那些以氯化胆碱为原料的深度共晶溶剂（如ChCl:D-Sor和ChCl:Xyl），能够显著提升纤维素酶的活性。在含有50%重量百分比的氯化胆碱-多元醇基深度共晶溶剂的条件下培养后，纤维素酶的活性提升幅度甚至超过对照组的两倍。荧光光谱分析

CRediT作者贡献说明

Madushmita Hatimuria：负责撰写原始草稿、确定研究方法、开展实验研究、进行正式分析以及数据整理工作。Jyoti Vishwakarma：同样负责撰写原始草稿、确定研究方法、开展实验研究、进行正式分析以及数据整理工作。V. Ananya：负责正式分析以及数据整理工作。Anjali Anil：负责正式分析以及数据整理工作。C. Nikesh Chandran：负责正式分析以及数据整理工作。Subrahmanyam Sappati：负责正式分析以及数据整理工作。Krishna Gavvala：负责撰写文章的审阅与编辑工作、项目监督、项目管理工作以及相关正式事务。

利益冲突声明

所有作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关联或个人关系。

致谢

M.H.感谢印度科学和技术部的DST-INSPIRE奖学金项目（奖励编号：IF210147）。A.P.感谢印度科学和技术部的DST机构在DST-INSPIRE教师计划中提供的研究资助（奖励编号：IFA20- CH-333），以及印度科学和技术部的SERB机构提供的启动研究资助（文件编号：SRG/2023/000250）。J.V.感谢印度政府教育部的奖学金支持。S.S.则感谢格但斯克工业大学提供的支持。

Madushmita Hatimuria|Jyoti Vishwakarma|V. Ananya|Anjali Anil|C. Nikesh Chandran|Subrahmanyam Sappati|Krishna Gavvala|Ashok Pabbathi