《International Journal of Biological Macromolecules》：The role of intrinsic protein in the structure and gelation of citrus high methoxyl pectin
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•在pH值为2.5和6.0的条件下，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶可去除HMP中的内源蛋白质。•该内源蛋白质与RG-I以及HG的非酯化区域存在结合关系。•内源蛋白质能够提升凝胶的强度及抗变形能力。•通过氢键与疏水相互作用，内源蛋白质影响凝胶的形成过程。引言果胶是一种从植物中提取的天然阴离子
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在pH值为2.5和6.0的条件下，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶可去除HMP中的内源蛋白质。
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该内源蛋白质与RG-I以及HG的非酯化区域存在结合关系。
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内源蛋白质能够提升凝胶的强度及抗变形能力。
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通过氢键与疏水相互作用，内源蛋白质影响凝胶的形成过程。
引言
果胶是一种从植物中提取的天然阴离子聚合物，主要存在于中胶层和初生细胞壁中，它与纤维素、半纤维素共同构成稳定的结构网络[1]、[2]、[3]。关于果胶的研究涵盖了提取技术、结构表征、功能特性以及工业应用等多个方面，为果胶产业的发展提供了理论支撑[4]、[5]。近年来，人们越来越重视优化提取与改性工艺，以提高产量并赋予果胶特定功能[6]、[7]。这些进展不仅凸显了果胶作为可再生生物聚合物的重要性，也符合循环经济与可持续工业发展的理念[8]、[9]。
从结构上看，果胶是一种异质多糖，其化学组成与物理化学性质会受到植物来源及加工条件的显著影响[10]、[11]。多数研究认为果胶由三种结构单元组成：同半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I（RG-I）以及鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（RG-II）[12]。根据甲基酯化程度，果胶可分为高甲氧基果胶（HMP，DE值＞50%）和低甲氧基果胶（LMP，DE值＜50%）[10]。HMP因其高度甲基酯化的同半乳糖醛酸区域而表现出独特的凝胶行为。在酸性环境及高糖浓度条件下，HMP链主要通过氢键与疏水相互作用聚集，从而形成三维凝胶网络[13]。研究表明，果胶凝胶的形成源于分子链的聚集，最终凝胶的性能取决于分子结构、分子间相互作用以及交联位点的稳定性。与低甲氧基果胶和酰胺化果胶相比，HMP的分子结构更为完整，更接近果胶的天然形态；而后者则是经过化学或酶法改性的形式，其凝胶化主要依靠钙离子带来的离子相互作用[14]、[15]。
除了碳水化合物主链外，HMP还含有少量但具有重要功能的非碳水化合物成分，如灰分、蛋白质、乙酰基以及阿魏酸[16]、[17]。其中，内源蛋白质也被称为内生蛋白质，它在提取后仍与果胶保持结合，可能以共价或非共价方式与多糖基质相连。HMP中含有相当数量的内源蛋白质，这一成分很可能会影响其功能特性。研究表明，果胶中的内源蛋白质富含羟脯氨酸，其含量因提取方法及原料不同而有所差异，大致在2.0%到11.0%之间[18]、[19]、[20]、[21]。
蛋白质能够与其他大分子如多糖、多酚发生强烈相互作用，形成复杂结构，进而改变这些物质的物理化学性质[22]、[23]。在果胶中，内源蛋白质被认为与鼠李半乳糖醛酸聚糖-I结构单元中的中性糖侧链存在共价连接，尤其在甜菜果胶中，这类蛋白质的含量可超过10%，这一现象引起了学界的大量关注[24]、[25]。利用胃蛋白酶进行的水解实验表明，去除内源蛋白质会降低果胶的分子量，减弱其乳化能力，并降低界面稳定性[24]。此外，还有研究显示，富含蛋白质的组分会优先吸附在油水界面，这说明这些蛋白质会主动迁移至乳液界面并起到稳定作用[17]。最近针对茶渣提取物中果胶的研究进一步表明，去除蛋白质能增强果胶链之间的自交联及钙桥连接，这进一步证实了蛋白质-果胶复合物在结构与功能上的重要作用[26]。综合来看，即便少量的内源蛋白质也能作为重要的结构与功能调节因子，影响果胶作为乳化剂和凝胶剂的宏观表现。
尽管已有诸多研究，但含内源蛋白质较少的柑橘果胶却相对较少受到关注。需要指出的是，较低的蛋白质含量并不意味着其功能作用可以忽略，因为即使是少量的蛋白质也可能在关键的结构或界面部位发挥作用，从而对果胶的宏观性能产生显著影响。有研究显示，从柑橘果皮中提取的解聚果胶在酸性条件下可作为高效的食品乳化剂[27]。这种乳化能力源于一小部分疏水性蛋白质与高度分支的多糖结构之间的共价结合。然而，目前对于柑橘高甲氧基果胶中内源蛋白质的作用了解仍然有限。尤其是蛋白质如何影响柑橘果胶的分子结构、凝胶行为以及具体功能机制，目前尚不明确。我们推测，柑橘高甲氧基果胶中的内源蛋白质可能会改变其分子结构，进而影响其凝胶机制与功能表现。
在本研究中，我们选择了胃蛋白酶和木瓜蛋白酶作为代表酶，分别在酸性条件（pH 2.5）和近中性条件（pH 6.0）下用于去除蛋白质。这两种pH值在食品加工中较为常见，且对应着果胶不同的构象状态。在酸性条件下，羧基的质子化会降低静电斥力，促进分子聚集，使果胶呈现更紧凑的构象，这可能部分遮盖果胶基质中的蛋白质结合位点，降低酶的接触机会。而在近中性条件下，羧基去质子化会导致静电斥力增加，使果胶链伸展，构象更加松散，这有利于蛋白质基团的暴露，提高酶的活性。因此，这两种pH条件为研究果胶构象差异如何影响内源蛋白质的酶法去除提供了良好的研究框架。随后，我们系统分析了酶解前后果胶的结构特征、基本物理化学性质以及凝胶强度，探讨了蛋白质对果胶的影响，同时分析了蛋白质在果胶水凝胶形成与稳定中的作用，从而全面理解果胶结构与其功能特性之间的关系，为其在不同领域的应用提供更有针对性的依据。
章节摘要
材料
本研究使用的原始柑橘高甲氧基果胶（HMP，DE值为62.61±0.98%，Gal-A含量为76.17±0.18%（重量百分比））由中国广州柠檬生物科技有限公司提供。该果胶是通过酸提取、酒精沉淀、干燥以及粉碎等步骤制得的。总蛋白质定量检测试剂盒购自南京建城生物工程研究所。用于去除HMP中蛋白质的酶为胃蛋白酶（来自广西南宁庞博生物工程有限公司，活性单位≥3000单位/克）和木瓜蛋白酶（来自广西南宁庞博生物工程有限公司）。
蛋白质去除效率
我们采用Bradford检测法，通过595纳米处的紫外-可见光谱检测，对酶解前后果胶中的蛋白质含量进行了测定。在pH 2.5的条件下，胃蛋白酶处理1小时后，果胶中的总蛋白质含量从4.56±0.08%降至1.25±0.04%，蛋白质去除效率为72.59%。同样，在pH 6.0的条件下，木瓜蛋白酶处理2小时后，蛋白质含量从4.34±0.06%降至0.46±0.02%，蛋白质去除效率达89.40%。这两种酶均能有效去除果胶中的蛋白质。
结论
本研究通过胃蛋白酶和木瓜蛋白酶去除HMP中的蛋白质，分别实现了72.59%和89.40%的去除率。酶解处理后，我们制备了糖酸凝胶，并对果胶的结构特征、物理化学性质以及凝胶行为进行了系统分析。研究结果表明，内源蛋白质不仅与RG-I结构单元相关，还与HG结构单元的非酯化区域存在结合关系。我们进一步……
作者贡献说明
陈佳文：负责原文撰写、软件使用、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思等工作。王金梅：负责研究指导与概念构思。廖金松：负责资源协调与资金申请工作。齐俊儒：负责论文审阅与编辑、研究指导、项目管理、实验实施以及概念构思等工作。
资金支持信息
本研究得到了以下机构的支持：中国广东省基础与应用基础研究基金（项目编号：2024A1515011120），柑橘功能性产品联合研发中心资助项目（项目编号：2020440002000849、2023440002001382），以及柑橘生物活性物质提取与苦味控制关键技术研究项目（项目编号：2025JCB10）。
利益冲突声明
所有作者声明，本人不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
我们要感谢中国广州柠檬生物科技有限公司作为原材料供应商，同时也感谢蛋白质研究中心的各位同事在实验操作及数据处理方面给予我们的帮助。
Jia-wen Chen|Jin-mei Wang|Jin-song Liao|Jun-ru Qi
