《International Journal of Biological Macromolecules》：In vitro and in vivo characterization of anti-inflammatory and antioxidant properties of colloidal lignin particles towards microglia
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木质素是地球上含量第二丰富的聚合物，几乎存在于所有植物与木材中。它是造纸工业的主要废弃物，因此是一种低成本且丰富的副产物。为实现其高值化利用，研究人员设想并开发了不同应用，包括具有低毒性、抗氧化与抗炎效应等良好生物特性的纳米颗粒，使其成为药物递送系统的良好候选
木质素是地球上含量第二丰富的聚合物，几乎存在于所有植物与木材中。它是造纸工业的主要废弃物，因此是一种低成本且丰富的副产物。为实现其高值化利用，研究人员设想并开发了不同应用，包括具有低毒性、抗氧化与抗炎效应等良好生物特性的纳米颗粒，使其成为药物递送系统的良好候选者。在本研究中，研究人员旨在制备并评估从软木中提取的胶体木质素颗粒（Colloidal lignin particles, CLPs）的抗氧化与抗炎特性，及其作为靶向神经炎症的药物递送系统的潜在用途。首先，研究人员使用BV2小胶质细胞系在体外研究了CLPs的生物特性。研究人员表明，CLPs无毒性，可被细胞快速内化，并能保护细胞免受细菌脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的炎症与氧化应激。此外，利用LPS诱导的全身与神经炎症小鼠模型，研究人员表明CLPs显著降低炎性介质的表达以及小胶质细胞的活化。这些发现证明了CLPs在神经炎症背景下具有前景的生物活性特性，及其自身作为治疗药物或作为治疗脑部疾病有效药物递送系统使用的潜力。
研究背景方面，神经炎症是脑内主要由小胶质细胞、星形胶质细胞及浸润的外周免疫细胞介导的炎症反应。虽然神经炎症是脑应对损伤或感染的自然反应，但小胶质细胞的慢性与失控活化可导致组织损伤、神经元功能障碍，并促进帕金森病与阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发生发展。这种失控的小胶质细胞活化被称为“反应性小胶质增生（reactive microgliosis）”，被认为是神经炎症发生与发展的重要因素。因此亟需开发疗效更好、副作用更少的创新型抗炎药与药物递送系统。纳米颗粒（Nanoparticles, NPs）因能包封药物、靶向特定细胞并具有生物活性，成为治疗脑内炎症过程的有力候选。木质素是仅次于纤维素的第二丰富天然聚合物，在制浆造纸工业中被视为低值副产物。胶体木质素颗粒（CLPs）是一类新型天然纳米颗粒，因天然来源而具良好安全性与生物相容性，可包封抗癌药、胰岛素、抗炎药等，且表面可功能化以实现控释与提高生物利用度。此外，木质素结构含酚羟基，具清除自由基与活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的抗氧化特性及抗炎效应。既往在斑马鱼胚胎模型中CLPs已显示一定抗炎趋势，但本研究选用哺乳动物模型即LPS注射诱导的急性全身与中枢神经系统炎症小鼠模型，以评估CLPs本身的抗神经炎症能力。研究人员制备了软木硫酸盐木质素来源的空CLPs，表征其在神经炎症背景下的内在能力，旨在证明其作为治疗药物或药物递送系统在神经炎症及相关脑疾病中的潜力。该研究发表于《International Journal of Biological Macromolecules》。
为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：使用软木Kraft木质素通过抗溶剂沉淀法制备CLPs及近红外荧光标记的CLP-NIR；通过动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）与透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）表征粒径、电位与形貌；采用小鼠小胶质BV2细胞系进行体外实验，以LPS诱导炎症模型；通过WST-1检测细胞毒性，流式细胞术分析表面标志物与摄取，荧光探针CellRox与MitoSox检测细胞与线粒体ROS，逆转录定量聚合酶链反应（Reverse Transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）检测基因表达；体内实验采用8周龄雌性BALB/c小鼠，建立腹腔注射LPS诱导的全身与神经炎症模型，经静脉给予CLPs，通过血清细胞因子流式微球阵列（Cytometric Bead Assay, CBA）分析、脑组织免疫荧光染色（Iba1抗体标记小胶质细胞）及器官近红外成像评估体内分布、抗炎与抗氧化效应。
研究结果如下。
3.1. Preparation and characterization of wood-derived NPs：研究人员通过抗溶剂沉淀法制备CLPs与CLP-NIR，DLS测得CLPs平均流体力学半径约116 nm，CLP-NIR约316 nm，电位在?30至?40 mV，TEM确认呈球形，IVIS与流式证实NIR染料成功包封且荧光稳定。
3.2. Cytotoxicity of NPs on mouse microglia BV2 cell line：研究人员通过流式、显微与WST-1检测发现，CLPs与纤维素纳米晶体（Cellulose Nanocrystals, CNCs）在浓度≥100 μg/mL时具显著细胞毒性，因此后续体外实验上限设为50 μg/mL，在此浓度内CLPs对BV2细胞无明显毒性。
3.3. Assessment of anti-inflammatory activation of the mouse microglia BV2 cell line by CLPs：研究人员通过RT-qPCR检测发现，CLPs在20 μg/mL显著上调抗炎因子白细胞介素（Interleukin, IL）-10表达，并以时间依赖方式在24 h上调精氨酸酶1（Arginase 1, ARG1）；对促炎基因IL-6、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）、IL-1β在不同时间点显著下调，而CNCs则倾向促炎，表明CLPs本身具抗炎症活化作用。
3.4. Reversion of the inflammatory activation of the mouse microglia BV2 cell line by CLPs and CNCs：研究人员先用LPS预激活BV2细胞6 h再加NPs 24 h，发现CLPs可轻微增强LPS诱导的IL-10表达，并倾向于降低促炎基因表达，在50 μg/mL对IL-1β显著抑制；CNCs则提升IL-6、TNF等表达，无抗炎作用。
3.5. Reversion of the inflammatory phenotype of mouse microglia BV2 cell line by CLPs：研究人员通过流式细胞术检测表面标志物发现，在LPS预激活后，CLPs剂量依赖性显著降低CD11b、CD14、CD16/32与CD40的表达，而CNCs无此效应，证实CLPs可逆转小胶质细胞炎症表型。
3.6. Assessment of antioxidant properties of CLPs on mouse microglia BV2 cell line：研究人员发现LPS可诱导诱导型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS）与环氧合酶2（Cyclo-Oxygenase 2, COX-2）转录，CLPs预处理可剂量依赖抑制其表达；在叔丁基过氧化氢（tert-butyl-hydroperoxyde, TBHP）诱导的氧化应激中，CLPs显著降低CellRox与MitoSox检测的胞内与线粒体ROS水平，效果与N-乙酰半胱氨酸相当，证明CLPs具抗氧化能力。
3.7. Uptake and sub-cellular localization of CLP NPs in mouse microglia BV2 cell line：研究人员通过CLP-NIR荧光显微镜与流式发现，BV2细胞以能量依赖方式主动内化CLPs，30 min内即可摄取，24 h内定位于细胞质且与溶酶体追踪染料共定位，不与线粒体或细胞核共定位，表明CLPs经内吞进入细胞并转运至溶酶体途径。
3.8. In vivo assessment of anti-inflammatory properties of CLPs：研究人员在LPS诱导的小鼠模型中静注CLPs（19 mg/kg），发现CLPs显著降低血清IL-6与TNF，脑组织中iNOS、IL-1β、TNF mRNA显著下调，Iba1染色显示小胶质细胞活化与形态改变被抑制；生物分布显示CLP-NIR主要富集于肝与脾，脑内未检出明显荧光，可能与CLP-NIR粒径增大影响血脑屏障（Blood Brain Barrier, BBB）透过有关，但模型下仍观察到脑内抗炎效应。
讨论部分总结：研究人员指出小胶质细胞是中枢免疫前沿细胞，其慢性促炎活化与神经退行性疾病相关，靶向小胶质细胞是神经炎症治疗策略。本研究使用LPS刺激的BV2细胞与小鼠模型评估CLPs生物活性。CNCs表现促炎倾向，故后续仅聚焦CLPs。CLPs平均约110 nm，载NIR后增至316 nm，可能与包封或聚集有关。CLPs在≤50 μg/mL无毒性，可被BV2快速主动内化并定位于溶酶体。CLPs下调促炎基因与表面活化标志物，上调ARG1与IL-10，提示向抗炎修复表型偏移，可能通过干扰TLR4与NF-κB通路或激活NRF2发挥效应。CLPs显著降低细胞与线粒体ROS，具抗氧化能力。体内主要富集于肝脾，脑内虽未检出荧光但仍减轻脑内炎症与微胶质活化，可能与模型下BBB通透性改变或CLPs本身活性有关。研究表明CLPs在体外与体内均具安全、抗炎与抗氧化特性，可作为治疗药物或药物递送系统靶向神经炎症中的反应性小胶质增生。
结论部分翻译：总之，本研究强调了CLPs在LPS刺激的BV2小胶质细胞体外模型与LPS诱导的神经炎症模型体内中的安全性、抗氧化与抗炎特性。这些发现表明，这些天然纳米颗粒具有作为治疗药物或药物递送系统用于在神经炎症期间靶向反应性小胶质增生的潜力。
