《International Journal of Biological Macromolecules》：Deciphering the conformational and functional alterations of α-glucosidase induced by emerging tire-derived contaminants 6PPD and 6PPD-quinone
编辑推荐：
•6PPD/6PPD-醌与α-葡萄糖苷酶的自发结合主要是由疏水作用驱动的。•6PPD能增强α-葡萄糖苷酶的活性，而6PPD-醌则会抑制其活性。•多种方法相互印证了α-葡萄糖苷酶构象发生了变化。•6PPD和6PPD-醌通过不同的相互作用方式与α-葡萄糖苷酶结合。•通过丙氨酸扫描突变
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6PPD/6PPD-醌与α-葡萄糖苷酶的自发结合主要是由疏水作用驱动的。
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6PPD能增强α-葡萄糖苷酶的活性，而6PPD-醌则会抑制其活性。
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多种方法相互印证了α-葡萄糖苷酶构象发生了变化。
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6PPD和6PPD-醌通过不同的相互作用方式与α-葡萄糖苷酶结合。
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通过丙氨酸扫描突变技术找到了参与结合过程的关键残基。
引言
自20世纪60年代以来，N-(1, 3-二甲基丁基)-N′-苯基对苯二胺（6PPD）作为一种高效的抗氧化剂被广泛应用于轮胎橡胶制造行业，对于延长轮胎使用寿命起着关键作用[1]。6PPD主要通过轮胎磨损颗粒释放到环境中，而这些颗粒是在车辆正常行驶过程中不断产生的[2]。然而，这种不可或缺的轮胎添加剂却产生了另一种令人担忧的环境污染物——6PPD-醌（见图1）。具体而言，在高温和臭氧环境下，轮胎磨损颗粒中的6PPD会被氧化成6PPD-醌，随后进入大气和灰尘中。
根据环境监测研究，6PPD和6PPD-醌在全球范围内都有存在[3]。在 aquatic生态系统中，加拿大水域中的6PPD-醌浓度在20到720纳克/升之间[4]。在空气中，来自中国六个典型城市的颗粒物样本中，有81%的样本检测出了6PPD和6PPD-醌的存在[5]。在灰尘中，德国道路灰尘中的6PPD-醌含量最高可达270峰面积/毫克[6]。此外，这两种物质也常见于室内环境，成为人类接触它们的重要途径[7]。与此同时，关于人类接触这些物质的研究也日益受到重视。在广州居民的尿液样本中，6PPD和6PPD-醌的检出率分别高达60%和100%[8]。而且，孕妇体内的这两种物质含量比其他成年人更高，这表明它们可能对生殖健康构成威胁[8]。此外，6PPD-醌也在人类血清和脑脊液中检测到，这进一步提示其可能存在神经毒性风险[9]、[10]。在毒性方面，自从田等人首次报道6PPD对大马哈鱼具有极强的致死毒性（LC50=0.095微克/升）之后，它就引起了广泛关注[11]。后续研究还发现，用6PPD/6PPD-醌处理的斑马鱼孵化率降低，心脏发育异常，并出现氧化应激现象[12]、[13]。此外，小鼠接触这些化合物后也会出现肝脏毒性[14]。人类健康所面临的潜在风险也不容忽视。李等人指出，6PPD会抑制人类胚胎肺成纤维细胞的生长并引发其凋亡[7]。 Yu等人的研究则表明，6PPD-醌暴露会导致卵巢损伤，进而降低生育能力[15]。综上所述，6PPD和6PPD-醌的普遍存在及其可能带来的健康危害，凸显出有必要对这些化合物展开进一步研究。
值得注意的是，方等人发现，短时间内接触6PPD的小鼠肝脏中的葡萄糖代谢出现了显著变化[16]。另外，2024年的一项研究显示，在秀丽隐杆线虫中，6PPD-醌会改变胰岛素和AMPK信号通路的表达，从而扰乱其葡萄糖代谢[17]。这些研究都表明6PPD、6PPD-醌与葡萄糖代谢之间存在关联。葡萄糖代谢是维持人体正常生理功能的核心过程，一旦出现紊乱就会导致高血糖，而长期的高血糖往往还会发展成糖尿病。预计到2030年，全球糖尿病患者人数将达到6.43亿，其中2型糖尿病占大多数[18]、[19]。控制不佳的糖尿病可能会引发严重的并发症，如肾病、视网膜病变和心血管疾病，不仅会对患者健康造成严重威胁，还会带来巨大的社会经济负担[20]。
α-葡萄糖苷酶是葡萄糖代谢过程中的关键限速酶，主要存在于肠道黏膜上皮细胞的刷状缘上[21]。它的核心功能是水解碳水化合物中的α-1,4糖苷键，将其转化为葡萄糖，从而参与调节餐后血糖水平[22]。因此，α-葡萄糖苷酶被视为2型糖尿病的重要药物靶点，其活性异常与糖尿病、肥胖等代谢性疾病直接相关。基于这一机制，近年来有许多研究致力于从天然产物中寻找α-葡萄糖苷酶抑制剂[23]、[24]。不过，除了天然产物和临床药物之外，环境中普遍存在的污染物也可能意外与α-葡萄糖苷酶发生相互作用，从而干扰正常的生理代谢过程。例如，秦等人证明，OH-多氯联苯能够抑制肠道菌群中的α-葡萄糖苷酶活性，可能引发肠道菌群失衡，进而影响人类健康[25]。同样，双酚S对α-葡萄糖苷酶活性的影响也呈现浓度依赖性：低浓度时略有激活作用，中等浓度时起抑制作用，高浓度时则会有明显激活效果[26]。目前，关于6PPD/6PPD-醌如何影响α-葡萄糖苷酶活性以及二者之间相互作用的研究还比较少。考虑到α-葡萄糖苷酶在葡萄糖代谢调节中的核心作用，对这一问题展开全面研究具有重要意义。
本研究结合多光谱技术、酶活性测定、原子力显微镜以及计算机模拟，研究了6PPD、6PPD-醌与α-葡萄糖苷酶之间的相互作用。这些研究有助于阐明6PPD和6PPD-醌在分子层面干扰葡萄糖代谢的潜在机制，同时为预防和治疗糖尿病提供新的思路。
章节要点
化学品与试剂
所用试剂的来源如下：6PPD（产品编号：N858057），购自上海麦克林生化有限公司；6PPD-醌（产品编号：TRC-P348790），购自德国LGC Labor GmbH公司；α-葡萄糖苷酶（产品编号：S10050，活性≥50单位/毫克），来自上海源恩生物科技有限公司，提取自酿酒酵母。实验中使用了浓度为0.05摩尔的HEPES缓冲液来维持稳定的实验条件。本研究中使用的所有试剂均为
紫外-可见吸收光谱
紫外-可见吸收光谱为研究α-葡萄糖苷酶与配体之间的相互作用提供了重要信息[31]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外-可见吸收特性主要集中在210–300纳米的波长范围内[32]。当α-葡萄糖苷酶与配体相互作用时，这些残基的微环境及构象可能会发生变化，从而导致紫外-可见吸收光谱出现相应改变。如图2所示，有两种
局限性与展望
酶活性测定中使用的6PPD和6PPD-醌浓度为10^-4至10^-5摩尔/米范围，这一浓度高于人类和环境中通常的暴露水平（纳摩尔级别）。尽管如此，这些研究结果仍为未来的动物实验和体内暴露试验提供了依据。此外，由于稳定性好且重复性好，酿酒酵母来源的α-葡萄糖苷酶一直是用于初步筛选抑制剂的常用工具。不过，这种微生物酶并非完全
结论
综上所述，本研究运用多光谱技术、酶活性测定、原子力显微镜以及计算机模拟等方法，研究了6PPD和6PPD-醌与α-葡萄糖苷酶的结合行为。研究结果表明，疏水作用是6PPD/6PPD-醌与α-葡萄糖苷酶自发结合的主要驱动力。酶活性测定显示，6PPD能够以非剂量依赖的方式增强α-葡萄糖苷酶的活性，而6PPD-醌则会抑制其活性
作者贡献说明
周岩：论文撰写——审阅与编辑、原始草稿撰写、软件使用、资源准备、方法设计、正式分析、数据整理。史静飞：论文撰写——审阅与编辑、可视化处理、软件使用、方法设计。马玉坤：论文撰写——审阅与编辑、结果验证、软件使用、数据整理。杨金奇：论文撰写——审阅与编辑、结果验证。魏亚楠：论文撰写——审阅与编辑。李继祥：结果验证。林欣尔：结果验证。涂勋：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
中国国家自然科学基金（项目编号：22064012和32460306）。江西省自然科学基金（项目编号：20242BAB25202）。南昌大学大型仪器开放共享与自制设备研究项目（项目编号：NCUSSC-202523）。
周岩|史静飞|马玉坤|杨金奇|魏亚楠|李继祥|林欣尔|涂勋|杨淑玲|迟宝珠
