接种Megasphaera elsdenii对乳酸驱动暗发酵微生物群落结构的影响及其在富含乳酸废水中代谢通路的驱动作用

《International Journal of Hydrogen Energy》：Inoculation of Megasphaera elsdenii influences microbial community structure and drives metabolic pathways in lactate-driven dark fermentation from lactic acid-rich effluent

　　

乳酸驱动暗发酵在利用富含乳酸底物进行氢气（H2）生产方面具有较大潜力，但其微生物机制主要在批次培养中被探讨。在稳态条件下，微生物相互作用可能改变乳酸转化过程，潜在抑制耗乳酸细菌（Megasphaera elsdenii）。在本研究中，研究人员以富含乳酸的食物垃圾渗滤液为进料，在序批式反应器（Sequencing Batch Reactors）中评估了使用原生群落或外源添加M. elsdenii的产氢情况。原生接种物实现了最高产氢量（1039.7 mL/Lreactor），而M. elsdenii接种物迅速转变为产甲烷阶段，达到660.6 ± 54.6 mL CH4/Lreactor。观察到对比明显的微生物网络：在原生系统中，由新兴的M. elsdenii主导的限制性群落有利于产氢；而在接种反应器中，由M. elsdenii和Prevotella组成的较小且集中的网络与产甲烷耦合。这揭示了乳酸代谢如何受初始接种物形成的微生物群落影响。

研究背景方面，乳酸近年来作为通过乳酸驱动暗发酵进行氢气（H₂）生产的前体受到广泛关注，许多复杂有机废物流如食物垃圾、农工残渣及发酵出水因乳酸菌（LAB）增殖天然积累高浓度乳酸，这些LAB主导的群落强烈影响代谢通量，常抑制经典产氢途径并限制源自富碳水化合物底物的H₂产量。乳酸驱动暗发酵代表一种替代路径，乳酸本身成为主要电子供体和碳源，即使在LAB或酸性条件下也能形成H₂。其中Megasphaera elsdenii被认为是高效消耗乳酸转化为挥发性脂肪酸（VFAs）、电子和H₂的有前景候选菌，其优先消耗乳酸而非葡萄糖，通过丙烯酸酯途径（acrylate pathway）快速转化乳酸为乙酸和丙酸而无二次生长滞后。然而在连续或实际底物系统中，竞争性H₂生产显著受限，稳态发酵促进更复杂微生物 consortium 发展，合作、竞争、互养和对抗等相互作用同时发生，影响底物路由、还原当量分布及终产物分布，即便乳酸被消耗也报道了 modest 或不稳定H₂产率。这种批次与实际运行间的差异表明生态背景而非单纯代谢能力决定乳酸驱动暗发酵成功，尤其在长期非无菌条件下产甲烷种群难以完全抑制。关键因素是稳态下微生物动态演变，M. elsdenii虽丰度占优但可能因不利相互作用功能受限。目前乳酸消耗菌整体生态相互作用影响发酵结果仍知之甚少，微生物组织、互作模式和功能谱如何决定代谢转向H₂或替代途径尚不清楚。因此研究人员评估两种接种条件：底物中原生微生物群落和外源添加M. elsdenii，以发酵食物垃圾液相为富含乳酸底物在序批式反应器（SBR）操作，通过微生物共现网络分析、拓扑角色评估和功能性KO谱推断潜在互作、连接模式和代谢能力，提供整合系统层面分析关联反应器性能、群落结构、网络拓扑和预测功能潜力，区别于以往在SBR中用复杂实际底物直接比较M. elsdenii生物强化与原生群落性能。

关键技术方法方面，研究人员使用发酵食物垃圾液相为乳酸源不经预处理保留原生群落，外源接种M. elsdenii ATCC 25940纯菌株，在SBR中以平均17.4 ± 3.2 g/L乳酸运行，水力停留时间（HRT）69 h，交换体积70%，pH 6.0，37°C。通过自动甲烷潜能测试系统测生物气，高效液相色谱（HPLC）测代谢物，气相色谱（GC）测H₂和CH₄组成。采用改良Gompertz模型拟合动力学，非度量多维尺度（nMDS）和单因素PERMANOVA分析群落相似性，典范对应分析（CCA）关联微生物与工艺性能。通过分子生态网络分析（MENA）基于随机矩阵理论构建ASV水平共现网络，用Gephi可视化并计算模块内（Zi）模块间（Pi）连通值分类节点角色。DNA提取后扩增16S rRNA基因V4区进行Illumina MiSeq测序，DADA2处理获ASV，SILVA v138注释，PICRUSt2预测功能基于KEGG Orthology（KO）表分析代谢潜力。

研究结果部分保留原文小标题说明如下。

3.1. Evaluation of the initial concentration of lactic acid for H₂ production by M. elsdenii 研究表明乳酸浓度对H₂产量有显著影响呈正相关，最高在16.0 g/L达1505.4 ± 20.1 mL/L_reactor，最低3.0 g/L为265.7 ± 16.5 mL/L_reactor。M. elsdenii通过丙烯酸酯途径转化乳酸，耐受LAB细菌素，缩短滞后期至3.9-9.3 h优于热处理污泥15.9-29.5 h。乳酸在第一天消耗超80%完全耗尽，碳水化合物虽存在但不影响M. elsdenii对乳酸偏好，其乳酸消耗速率快于葡萄糖6倍。液相代谢物中16.0 g/L时丁酸（butyrate）主导4.4 g/L，丙酸（propionate）3.2 g/L，乙酸（acetate）2.2 g/L，首日丙酸出现符合丙烯酸酯途径激活，次日丁酸增加显示代谢转向还原丁酸形成以维持氧化还原平衡，证实底物充足时倾向丙酸，耗尽后转向丁酸。

3.2. Evaluation of M. elsdenii in lactate-driven dark fermentation in SBR 原生接种物在第9周期达最高1039.7 mL H₂/L_reactor，末三周期平均588.8 ± 40.4 mL H₂/L_reactor，M. elsdenii接种物早期H₂下降并持续检出CH₄，末三周期平均660.6 ± 54.6 mL CH₄/L_reactor，电子回收率原生43.6%向H₂，Me-inoculum 50.4%向CH₄。批次未见产甲烷而SBR出现，归因于长HRT近中性pH利于古菌生长，原生虽同条件末周期才检到产甲烷说明群落结构而非仅非生物条件决定。原生H₂变异系数46.6%，Me-inoculum前期44.3%相似波动。乳酸消耗均超92%，但代谢归宿不同。

3.2.2. Analysis of the microbial community and metabolic patterns 原生初期由Lactobacillus ultunensis 56.3%和Clostridium sensu stricto 1 31.5%主导，运行中转为M. elsdenii 71.8%伴Olsenella umbonata 3.8%等，CCA显示M. elsdenii与乳酸消耗、乙酸丙酸丁酸及H₂正相关弱关联CH₄，产甲烷古菌Methanobrevibacter boviskoreani和Methanobacterium petrolearium约0.8%边际存在。Me-inoculum始末M. elsdenii占96.3%至72.6%伴Prevotella buccae 5.8%等，CCA示乳酸消耗与H₂负关与CH₄及丙酸强正关，末周期M. boviskoreani达2.4%，还原当量转向产甲烷。

3.2.3. Co-occurrence network analysis and topological roles 原生网络26模块335节点2396互作，聚类系数高路径长短，模块化显著低具高度整合结构，M. elsdenii占90节点74%互作但模块内连通高模块间低呈代谢特化非拓扑整合，LAB如Olsenella具跨模块沟通正互作22.7%负互作与产氢菌可能抑制，Sporanaerobacter桥接各群。Me-inoculum网络33模块231节点716互作更小碎片但模块化0.441结构化，M. elsdenii占68节点72.4%互作分布9模块，Prevotella具模块间连通，LAB影响减弱，Methanobrevibacter显模块间沟通占4.5%正互作与Mogibacterium等，耦合乳酸发酵与产甲烷致CH₄高H₂低。原生大而互联M. elsdenii受限自身模块LAB跨模块沟通利H₂，Me-inoculum小而集中M. elsdenii与Prevotella耦氢营养古菌利CH₄。

3.2.4. Functional profiles in lactate-driven dark fermentation KO谱确认乳酸为核心代谢轴，两条件均丰 glycolysis K00844等和乳酸代谢K00016等，原生乳酸氧化K03303几乎专属Megasphaera，Me-inoculum还赋Prevotella。水解K01179稀缺限Olsenella等。氢营养产甲烷K18209等归Methanobrevibacter，Me-inoculum耦合互养。原生功能弱连水解与产甲烷利H₂积累酸发酵，Me-inoculum多类Megasphaera、Olsenella、Prevotella、Methanobrevibacter协调网络还原当量向产甲烷非游离H₂。功能谱为预测非表达证据。

讨论总结部分，研究人员指出乳酸驱动暗发酵依接种呈两分明代谢结局，原生利产氢平均588.8 ± 40.4 mL H₂/L_reactor，Me-inoculum转产甲烷660.6 ± 54.6 mL CH₄/L_reactor，非乳酸可及度超92%驱动而关群落结构与功能潜力。原生M. elsdenii为代谢聚焦节点共存Olsenella和Lactobacillus供糖酵解和乳酸转化KO支持H₂导向发酵；Me-inoculum代谢共享M. elsdenii与P. buccae，M. boviskoreani具模块间连通促H₂耗与CH₄成。微生物互作由原生的或加M. elsdenii塑造决定乳酸向H₂积或互养CH₄产。本研究提供整合系统层面视角关联性能、结构、网络与功能，洞察接种策略影响实际食物垃圾底物乳酸驱动暗发酵。论文发表于《International Journal of Hydrogen Energy》。

结论部分翻译：乳酸驱动暗发酵表现出两种明显不同的代谢结果，取决于接种物：原生接种物有利于产氢，达到588.8 ± 40.4 mL H₂/L_reactor，而Me-inoculum转向产甲烷，产生660.6 ± 54.6 mL CH₄/L_reactor。这些差异不仅由乳酸可及性驱动（其始终保持在92.0%以上），而是与微生物网络结构和预测功能潜力的变化有关。在原生成分中，M. elsdenii作为一个代谢聚焦节点与Olsenella和Lactobacillus共存，共同提供关键的糖酵解和乳酸转化KO（K00844、K00873、K01810、K00016、K03778），可能支持面向H₂的发酵。相反，在Me-inoculum中，发酵代谢由M. elsdenii和P. buccae共享，而M. boviskoreani表现出更强的模块间连通性，可能促进了H₂消耗和CH₄形成。总体而言，由原生群落或添加M. elsdenii形成的微生物相互作用，与乳酸是被导向H₂积累还是互养CH₄生产有关。本研究提供了一个系统层面的视角，整合了反应器性能、微生物群落结构、网络拓扑和预测功能潜力，为使用复杂食物垃圾衍生底物的不同接种策略如何影响乳酸驱动暗发酵提供了新的见解。

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