综述：密度梯度离心法分离胶体粒子：技术与实用指南

《ADVANCES IN COLLOID AND INTERFACE SCIENCE》：Separation of colloidal particles by density gradient centrifugation: Techniques and practical guidelines

　　

精确分离纳米粒子和胶体粒子对于众多科学、技术和工业应用至关重要，影响着材料科学、制药和基础科学研究等领域。本综述系统地探讨了密度梯度离心（density gradient centrifugation），这是一种广泛用于按尺寸、密度和形状分离粒子混合物的技术。文中深入阐述了离心过程中粒子行为的科学原理，包括沉降动力学、粒子与介质的相互作用以及粒子形态和扩散的影响。该综述还讨论了梯度离心中常见的实际挑战，例如维持梯度稳定性和实现最佳分离分辨率。此外，还讨论了实用的实验方法和优化策略，以提高分离的效率、重现性和可靠性。目的是提供全面、详细的指南，使研究人员能够在实验室环境中执行有效、准确和重现性良好的胶体粒子分离。

1. 1.
   引言
   胶体在创造材料、药物递送系统以及作为胶体相互作用基础研究平台等方面具有巨大潜力。不同尺寸和形状的胶体即使由相同材料组成，也可能表现出不同的性质。这些粒子的应用和性能取决于样品的尺寸、纯度和均匀性。通常，即使经过大量合成工艺优化，粒子合成仍可能导致非均匀样品。胶体分离方法是合成优化的一种互补方法，可用于获得高度均匀的粒子。根据待分离粒子系统的尺寸和类型以及所需的均匀性等因素，决定采用何种方法。选择分离方法时需考虑的评价标准包括：尽可能多地分成多个馏分、对不同维度（从零维量子点到二维片层）的灵活性、大粒子范围和溶解度、最小样品损失、保持固有胶体性质（避免聚集）以及实现可重复的结果。另一个重要标准是分离技术的可扩展性。关于胶体粒子的分离，离心具有高度通用性，无需额外功能化或修饰即可实现分离。根据所需结果，离心管中的介质可以是均匀的（差速离心）或包含梯度（密度梯度离心）。差速离心最常用于将粒子从周围介质中分离，沉淀物或上清液为目标组分。相比之下，密度梯度离心通常用于分离不同密度的粒子。这可以通过将粒子密度与介质密度匹配（等密度分离，isopycnic separation）或利用胶体的不同沉降速度（速率区带分离，rate zonal separation）来实现。两种离心方法可依次用于分离更复杂的粒子混合物。梯度离心技术的发展源于生物化学家试图分离细胞以了解动植物的不同细胞器和细胞成分的作用。1938年，Martin Behrens首次使用等密度密度梯度分离细胞组分。梯度离心的发展是许多科学家多年努力的结果。Brakke在1953年首次描述了速率区带分离的指导原则，Christian de Duve及其研究团队对理论发展做出了重要贡献（其工作导致了过氧化物酶体和溶酶体的发现，并因此于1974年获得诺贝尔奖）。近年来，该技术已应用于其他科学领域以分离胶体粒子。粒子尺寸、密度或形状均可驱动这些分离。该方法已成功应用于多种（纳米）粒子的纯化，包括聚合物粒子、磁性粒子、量子点、二氧化硅、碳纳米管、硅纳米晶体和金属有机框架（MOFs）等。
2. 2.
   背景
   2.1 离心类型
   离心在胶体化学中频繁使用，可根据被分离体系的规模和粒子尺寸在不同转速下进行。大规模分离可在工业级设备中进行，但大多数实验室工作使用较小规模台式设备。实验室规模的分离主要在离心管中以批次方式进行，因此本节以此为重点。
   2.1.1 差速分离
   差速离心是实验室中最常用的离心技术之一，用于从溶剂或溶液中去除粒子。粒子在离心管中均匀分布，溶液密度均一。随着离心进行，管底形成沉淀，上清液变澄清。该方法不易实现单一悬浮液中不同胶体群体的分离。不同胶体的均匀分布导致低沉降速度胶体与高沉降速度胶体一同存在于沉淀中。分离不同群体通常需要多次离心-再分散循环，且分离分辨率和产率低。只有当沉降速率相差10倍或以上时，差速离心才能实现清晰的分离。差速离心的优势在于可使用固定角转子（比吊桶式离心机可达到更高转速和更大容量）。
   2.1.2 等密度分离
   不同密度的粒子可通过将其密度与介质密度匹配来有效分离。密度梯度范围需满足ρ_minimum < ρ_p < ρ_max。密度梯度越平缓，分离分辨率越高。分离分辨率定义为区带峰值间距除以区带宽度的二分之一。密度差异小至0.0032 g/cm³的粒子已被成功分离。粒子位于密度梯度上方，受离心力作用沿梯度向下移动，直至其密度等于周围介质密度。延长离心时间不会影响区带位置。该方法常用于分离具有不同直径、电子类型和带隙的碳纳米管。对于低密度粒子，可利用浮力根据其不同的漂浮速率进行分离。在这种情况下，粒子分散在比梯度更密的溶液中，并铺在密度梯度的底部。由于粒子尺寸与其密度成反比，此技术尤为有用。随着离心进行，粒子的速度因其与介质的密度差减小而降低。这些缓慢的沉降速度是此类离心需要长时间（超过10 h）的原因。粒子在密度梯度中的位置由其密度决定；等密度分离的离心时间取决于粒子的尺寸和形状。离心管的尺寸和方向也有助于缩短等密度分离的离心时间。离心管体积需足够大以分离所有区带，并且最好是短而宽的。类似的效果可通过选择使离心管在离心过程中保持直立（垂直转子）的转子来实现。离心开始时，密度梯度会重新配置，介质最高密度位于管外侧，装载的低密度样品靠近旋转中心。粒子到达等密度位置的距离大大缩短，停止离心后密度梯度重新定向。根据所用粒子离心系统，缩短的离心时间可能会降低粒子分离分辨率（区分一个区带与另一个区带的能力）。由于用于制备梯度的溶液常规范围，该方法通常用于密度约在0.9至1.4 g/cm³之间的粒子。
   2.1.3 速率区带分离
   速率区带分离利用粒子的不同沉降速率进行分离。梯度的最大密度需小于粒子密度（ρ_max < ρ_p）。它可被视为一种非平衡态分离，因为粒子不会到达密度匹配且不再沿密度梯度下移的位置。胶体混合物置于密度梯度顶部，离心时粒子通过梯度沉降。粒子不同的尺寸、形状和密度影响其沉降速率。随着离心进行，不同类型的粒子分离，以不同沉降速度通过介质梯度时形成区带。这种离心分离需要为每种胶体混合物选择密度梯度、离心时间和速度。如果样品离心不足，则不会形成不同粒子类型的区带。如果离心时间过长，含有所有粒子的沉淀将出现在离心管底部。当各区带尽可能分开或沿离心管均匀分布时，达到最佳离心持续时间和速度。速率区带分离的分离效率明显优于差速离心，但代价是每个离心管的样品装载容量减少。速率区带分离比等密度分离快得多，沉降速率差异15%的粒子已成功分离。对于大规模分离，区带转子更具吸引力。

2.2 粒子离心原理

密度大于分散介质的胶体在施加足够强的离心力时将沉降到离心管底部。即使在无离心场时，多种力同时作用于粒子：重力向下拉，浮力向上推，布朗运动随机作用，粘性摩擦力与净运动方向相反。不考虑扩散效应，在低密液体介质离心场中的粒子受到的离心力（F_c）大于浮力（F_b），导致粘性摩擦力（F_f）方向与离心力相反。离心场中的离心力和浮力可用角速度描述，其中离心加速度为ω²x。摩擦力取决于摩擦系数（f₀）和粒子性质。对于球形、刚性且不溶性粒子，且沉降速度足够慢以维持层流时，粘性摩擦力可用斯托克斯定律描述。从相关方程可得到刚性球形粒子在离心场中的运动方程，但该方程仅对单个粒子有效，忽略了粒子间和流体动力学相互作用及扩散效应。实际条件需要考虑这些附加参数。非理想粒子运动会因非球形粒子、粒子与梯度介质的相互作用以及粒子间相互作用而产生。

2.2.1 非球形粒子

粒子形状偏离理想球体时会改变所受拖曳力。非球形粒子比等体积球体沉降更慢。作用在粒子上的增加的摩擦力将减小运动方向的合力，从而降低沉降速度。对于非球形粒子，斯托克斯拖曳力的摩擦系数可通过非球度因子（f）调整以部分补偿沉降速率的变化。该因子将非球形粒子的摩擦系数（f_n）归一化为具有相同体积的等效球形粒子的摩擦系数（f₀）。等密度分离可视为平衡态分离。粒子将在离心管内移动直至达到平衡密度位置。力平衡简化后，可导出沉降速率是粒子形状与密度、介质密度与粘度以及角速度的函数。沉降系数（s）由此方程导出，常用于描述不同沉降材料的沉降速率，前提是粒子半径、形状和密度在离心过程中不发生变化。然而在密度梯度离心中需谨慎，因为梯度密度离心本质上涉及可变的密度和粘度分布。与等密度分离不同，速率区带分离不达到平衡态。因此描述该分离中粒子动力学的方程包含非零的二阶导数项。

2.2.2 扩散考虑

溶液中粒子的扩散取决于其尺寸、温度和介质粘度。扩散系数可用斯托克斯-爱因斯坦方程计算。随机行走位移可由均方位移方程描述。扩散通量由菲克第一定律描述。粒子浓度对沉降行为的影响可能比单纯影响离心过程中的扩散更为复杂。在高浓度下，由于粒子间复杂的流体动力学相互作用，沉降速率可能降低。实验数据和斯托克斯动力学模拟表明，沉降速度的降低可通过未被粒子占据的体积分数的幂律定量描述，指数约为4.65。增加粒子浓度还可能增加聚集，取决于特定粒子在给定介质中的缔合行为。处于区带边缘（浓度较低）的粒子可能因带中心局部浓度较高处粒子间缔合增强而沉降更慢。在存在非常非理想行为的粒子系统中，通常使用等效沉降系数来描述理想等效粒子的沉降行为。Lamm方程可描述离心场中粒子的沉降和扩散。该方程是特定类型的对流-扩散偏微分方程，已用于模拟分析离心实验，通过在不同浓度下进行实验获得不同溶质的扩散和沉降系数。同样，当这些参数已知时，可对粒子运动建模。Lamm方程假设离心过程中不发生化学反应或粒子凝聚。若此假设不成立，则必须相应修改方程。

2.2.3 对流流束电流

密度梯度有助于稳定沉降区带。因为粒子必须比离心介质致密才能穿过介质，它们会置换一些较轻的外围介质。若无密度梯度，沉降区带的密度将高于介质，并翻滚至离心管底部。最初认为稳定性条件仅仅是装载和区带密度不应超过下方梯度介质的密度。但实际情况更复杂。实验结果表明，该准则最初成立，但在密度梯度顶部的装载样品界面几秒后就会形成流束液滴。这种现象是导致密度梯度离心分辨率差的主要原因之一。对不稳定性的理解多年来有所改善。早期实验人员发现温和搅拌样品区带或将样品置于振动离心机上有助于减少流束液滴的形成。Velegol等人基于Rayleigh-Bénard不稳定性模拟了界面不稳定性，并阐明了有助于延长装载粒子溶液稳定性的实验变量，将热传递Rayleigh-Bénard不稳定性与该现象类比。他们考虑了密度梯度的陡度、装载样品的体积分数以及装载到梯度上的样品体积。发现装载体积分数大于0.001会导致固有的不稳定性（即指进），阻碍稳定分离区带的形成。较低的体积分数、较大的装载体积以及梯度中较小的扩散系数可改善装载样品的稳定性。作者通过在宽体积分数范围（低于1%）下离心聚苯乙烯粒子并在给定粒子体积分数下测试不同装载体积的沉降行为证明了这一点。此外，作者开发了定量模型来预测导致不稳定性的条件，基于待离心粒子的性质。

2.2.4 模拟技术

离心原理理论对于具有简单形状的单粒子已建立完善。虽然方程可确定性地处理单个粒子的运动，忽略扩散并允许计算轨迹和研究密度与粘度梯度的影响，但朗之万方法可解释扩散。通常，扩散的随机效应最好用Lamm方程考虑，可计算离心管中一群粒子的浓度分布。虽然Lamm方程的最简版本可解析求解，但考虑密度和粘度梯度的影响需要数值方法。更复杂的模拟方法特别需要用于两个目的：1）计算非球形粒子的扩散和沉降系数；2）解释高浓度粒子群离心（或沉降）中粒子间相互作用的作用。对于复杂形状粒子，计算其扩散和沉降性质一般需要先进数值方法求解斯托克斯方程。众所周知，在适用于描述纳米和亚微米粒子行为的斯托克斯体系中，扩散和沉降性质对于复杂形状粒子均为张量，所有相关信息包含在阻力矩阵中。需要用张量描述粒子行为意味着粒子离心结果取决于其取向。这意味着简单的扩散-对流方程应替换为广义Smoluchowski方程，追踪粒子位置和取向概率。一种非常有效的计算粒子流体动力学性质的计算方法是将其表示为球簇，对此有多重加法等高效方法可用。已开发出成熟的计算方法来计算此类物体的流体动力学性质。应注意的是，在这些条件下，簇经历的拖曳力不能用斯托克斯定律描述，因为其摩擦与方向有关，且平移和转动运动之间可能存在耦合。这意味着需要完整的扩散张量来描述其运动。但通常使用平均流体动力学半径来表征粒子的阻力。浓缩悬浮液一般沉降行为的模拟需要基于粒子的技术，如斯托克斯动力学（SD）、耗散粒子动力学和平滑粒子流体动力学。这些模拟策略可考虑各种粒子间相互作用，特别是流体动力学相互作用，这对于准确预测浓缩分散体的沉降速度至关重要。实际上，在高浓度下，粒子比在稀释条件下移动更快，这是因为位于群中央的粒子所经历的拖曳力被屏蔽。这种行为可定量建模为非占据粒子体积分数的幂律，与实验和模拟结果吻合良好。

2.3 离心机设置

加速度和减速度会影响密度梯度分离中区带分离的质量。振动和突然制动可导致界面混合，造成区带不明显或无法形成。许多实验室方案建议在离心结束时无制动减速以限制混合。当使用吊桶式离心机和浅密度梯度（水中高达20% w/w蔗糖）时，应使用最慢的加速和减速设置。缓慢加速保护梯度顶部的样品界面，缓慢减速减少减速结束时的混合。在低于5000 rpm的转速下，离心机速度的突然变化会引发科里奥利力，引起离心管内的旋流（这在管径较大和介质粘度较低时更普遍）。另一个选择是转子类型。主要有三种选项。固定角转子，顾名思义，包含多个相对于旋转轴成固定角度（通常在14°至40°之间）的管座。一般来说，较大角度缩短了沉降路径长度并可提高分离效率。离心过程中，粒子径向向外迁移直至接触离心管壁，然后在离心力持续作用下沿管壁滑向底部。此过程通常称为壁效应，是固定角转子中沉降的特征。固定角转子的优势包括高样品容量、低重心促进稳定运行以及坚固设计带来长使用寿命。然而壁效应也可能是限制因素。由于粒子沿管壁沉降，沉淀在加速尤其是减速期间更易受到干扰，若制动过猛可能会降低分离质量。吊桶式转子通常由四个或六个自由枢转的吊桶组成，静止时保持垂直悬挂。当转子加速（通常在200-800 rpm以上，取决于转子设计）时，吊桶向外摆动直至在离心力作用下接近水平。这种配置使吊桶式转子特别适合密度梯度离心。其主要优点是密度梯度与离心场对齐，允许粒子沿明确定义的路径通过梯度。运行结束时，梯度在转子旋转时保持水平，停止时恢复垂直方向，使分离的区带比固定角转子更容易观察和回收。主要缺点是沉降路径长度比固定角转子更长，因此通常需要更长的离心时间以达到相同的沉降程度。区带转子由一个密封的转子室组成，配有内部分区系统将转子分为几个扇形或隔室。装载时，密度梯度和样品通过中心端口引入。同时转子静止或以低速旋转，使液体均匀分布在整个室中。内部隔板有助于在装载和加速过程中保持密度梯度的完整性并最小化混合。区带转子中的沉降不同于固定角或吊桶式转子。由于粒子主要在连续密度梯度内沿径向迁移而非在单个管内，沉降路径明确且基本独立于管几何形状。因此，沉降粒子与固体表面的接触最小化，大幅减少了壁效应和相关的区带变形风险。区带转子具有多项优势：分辨率极佳、允许高速离心、便于回收分离馏分，并在整个分离过程中保持样品区带的完整性。其最大优势是能够单次处理相对大体积的样品（通常数十至数百毫升，取决于转子型号），使其对制备型应用极具吸引力。然而区带转子也有局限性。操作比传统管式转子技术要求更高，需要专用设备和仔细的装载、卸载及馏分收集程序。此外，由于样品直接接触转子室而非装在一次性离心管中，转子必须具有优异的耐化学性，并在每次运行之间彻底清洁以防污染和腐蚀。

2.4 密度梯度

梯度的类型、范围和构建方式影响粒子的沉降行为。梯度类型需针对待分离粒子和分离任务专门选择。理想情况下，溶质梯度不应与分离粒子结合或相互作用，也不应使其失稳或改变渗透压（对渗透压敏感的粒子）。溶质必须具有可产生所需密度范围（用于等密度或速率区带分离）的溶解度范围，且不会导致高粘度介质。物理和化学性质应已知，且粒子应易于从梯度介质中完全回收。介质的密度和粘度梯度以不同方式影响离心。粘度对沉降速率有反比影响，在较高粘度下延长离心时间。密度分布决定了离心过程中梯度的稳定性，防止装载样品的对流并保持沉降区带的稳定性。梯度可构建为离散或连续的。离散梯度是通过在离心管中叠加或垫底多层密度层构成的陡峭梯度。由于扩散效应，阶梯梯度通常不会长时间保持离散（除非使用不混溶介质构建）。

2.4.1 粒子-密度介质相互作用

溶液中的粒子可与梯度介质以不同方式相互作用。这些相互作用可通过溶剂和其中物种的选择进行修改或限制。溶剂分子可在粒子周围形成溶剂化层。该层的厚度取决于粒子性质（尺寸、电荷、表面性质等）和介质性质（盐浓度、聚合物浓度等），进而影响整体粒子尺寸和密度。溶剂化层厚度与粒子尺寸的比值决定了密度变化的程度。具有渗透性质的粒子在离心过程中可表现出差异性水合，因为沿离心管增加的渗透势可导致粒子失水。这可能导致粒子塌陷并在离心进行中引起沉降速度的巨大变化。粒子还可与密度介质中的物种发生更直接的相互作用。带电粒子在含有带电物种的介质中，其效应因体系而异。在高电荷体系中，介质中反离子的尺寸可极大影响粒子沉降速度。即使在低浓度下，带电物种也可增加某些粒子在介质中的分散性，而在其他体系中则可能完全破坏粒子稳定性。密度介质中的物种还可通过吸附或粒子在其它物种存在下发生的物理变化来改变粒子表面。

2.4.2 梯度形状

密度梯度可构建为沿离心管长度具有特定浓度分布。通过这种方式，可构建梯度形状以操纵粒子运动从而实现特定分离。密度和粘度不一定随浓度线性缩放；这些性质可能具有截然不同的分布，具体取决于密度介质。密度梯度可以是非连续或连续的。离心持续时间可将非连续梯度转变为连续梯度，因为溶质通过溶剂扩散。选择梯度形状受离心持续时间、离心机转速以及待分离粒子尺寸范围的影响。非连续梯度是阶跃梯度，可在离心管中铺设任意数量的台阶。最简单的形式是密度屏障，使用高密度溶液层，粒子溶液铺在其上。这种方法通常用于分离粒子溶液中最低或最高密度的粒子。非连续梯度层之间的突然转变可导致在这些界面处积累，从而引起聚集。连续梯度通常具有更高的分离分辨率。梯度的确切轮廓（线性、凹形、凸形、S形等）可使更宽范围的粒子得以分离。线性梯度是最容易制作的，通常表现出最小的与时间相关的形变。等动力学梯度构建为使粒子具有恒定的沉降速率（dx/dt = k）沿密度梯度下移。这不是线性梯度，因为密度必须满足沿离心管距旋转中心每个距离处的特定方程。这在管式离心中具有优势（简化方程、易于预测离心时间、易于估算沉降系数等），但在具有大扩散效应的样品中可能不利。剩余梯度形状导致非匀速运动。一些最简单的梯度具有随密度增加而增加的介质粘度，导致粒子在离心过程中减速（减速梯度）。相反，可制成反比例使粒子在离心过程中加速（加速梯度）。减速梯度的优势是可产生梯度诱导的区带变窄。区带前缘的粒子会遇到较高粘度，因此比后缘粒子移动更慢。当梯度足够陡时，区带宽度开始缩小。这通常通过在离心管底部构建急剧增加的密度梯度来实现。需注意，如果区带变得过于浓集，可能超载梯度。这可能导致密度梯度不稳定，降低离心质量；凸形梯度具有容纳较大样品装载量的优势。

2.4.3 梯度介质

密度梯度可使用多种技术构建，取决于期望的分布和所使用的密度介质。梯度介质包括整个溶液，即溶质、溶剂以及构成梯度部分的任何其他物种（如缓冲液或盐）。分层梯度是最简单的技术之一。通过连续在构建的梯度上方添加较低密度浓度或在底部增量添加较高密度溶液来形成阶梯梯度。这些不同梯度台阶界面处的扩散通常导致陡峭梯度仅在制作后短时间内存在。这种扩散可被用户利用，因为梯度可放置过夜以形成第二天使用的连续梯度。通过将离心管缓慢倾斜以增加扩散界面面积可加快扩散速率。对于可长时间保持阶跃状浓度分布的理想阶梯梯度，低温离心或不混相分层是一些已使用的选项。连续梯度也可通过不同类型的梯度仪直接形成。最常用的方法是双室混合系统，其中一个室为储液室，另一个为向离心管供料的混合室。根据哪个室具有较高密度，离心管可从顶部填充（储液室为低密度介质，混合室为高密度介质）或从底部填充（储液室为高密度介质，混合室为低密度介质）。此方法的最简单版本仅使用重力保持液位相等。可向室中添加活塞以控制流速。双室法可产生线性（等室或等活塞压缩）或凹凸梯度（不等室或不等活塞压缩）。另一种称为Gradient Master的方法由Biocomp Instruments开发，基于倾斜管旋转。该方法通过将两相阶梯梯度倾斜至特定角度并以规定转速旋转优化持续时间来形成快速、可重复的梯度。提供了常用梯度的目录方法。其数据库中未包含的其他梯度系统可通过连续旋转-停止循环购买或形成。自形成梯度不需要梯度仪，通过在足够高的离心速度下离心均匀浓度来形成。在速率区带离心中，梯度在分离执行前形成。在一些等密度分离中，梯度可在离心过程中形成，从梯度介质和粒子的均匀分布开始，最终在离心结束时得到分离的粒子区带。然而，若溶液中小的污染粒子在离心结束时尚未到达其位置，则应谨慎。

水性梯度材料选择。用于水性梯度的主要类型可分为不同类别。每类中常见溶质及与非生物分离相关的主要性质列于表2。粒子分离的标准是溶质与待分离粒子的相互作用。包括氢键、相反电荷间的电荷相互作用、离子强度和去稳定化、引起聚集的排空相互作用、引起粒子形状和密度变化的渗透压。有机梯度材料选择。有机介质梯度分离不如水性分离常见，但在胶体科学中很有价值。保持疏水性粒子在有机介质中而不改变其表面功能化，从而无需在水性介质中分离，可节省大量时间，并防止伴随溶剂变化而常见的不可逆聚集。用于分散在有机介质中的粒子的选择标准基于粒子表面性质。通常通过向有机溶剂中添加可溶性溶质来创建梯度，因为这允许容易地实现大的密度范围。当存在粒子稳定性或低粒子密度时，可通过组合两种不同密度的混溶有机溶剂来创建密度梯度。两种常用的溶剂混合物用于生成有机梯度：环己烷/四氯化碳和氯苯/2,4,6-三溴甲苯。前者用于因为环己烷是常见且相对便宜的有机溶剂，可溶于用于合成纳米粒子的多种其它有机溶剂中，且与四氯化碳组合时可产生0.78至约1.6 kg/L的密度梯度。该方法已成功用于纯化金、银和CdSe量子点。第二个体系已有效用于分离单壁碳纳米管和单分散硅纳米晶体。

2.5 粒子密度离心的当前方案

确切的方案取决于起始系统和期望结果。待分离系统的组成和体积影响离心机类型、管尺寸和无菌要求。待分离粒子的类型决定使用哪种离心方法以及所需的离心机取向。所用的密度梯度需要与粒子兼容（考虑下游处理）并与离心技术本身兼容。该方案不限于一步离心。可使用多次连续的梯度离心来实现所需分离。例如，使用多个步骤分离具有不同形状的金纳米星，特别是具有不同臂数的那些。等密度离心可分离出一个特定密度群体，然后速率区带离心可从该群体中分离出特定粒子或簇尺寸。大多数密度梯度分离程序通常是检查相同或相似粒子的现有方法的改进。当类似粒子分离的已发表方法可用时，可使用这些条件，稍作修改以优化分离。然而，当没有类似粒子尺寸和组成的公开数据时，找到正确的离心参数（运行持续时间、转速、温度等）可能具有挑战性。盲目迭代和尝试可能非常耗时且无效；应考虑建模方法。表3和表4列出了当前用于分离胶体粒子和胶体簇的一些最重要的密度梯度离心条件，分别针对水性和有机梯度介质中的分离。这些表限于三维粒子（胶体和簇状胶体）。关于一维和二维结构通过密度梯度分离的更详细文献综述可在其它综述中找到。高密度粒子和簇（如无机金和银纳米粒子）通常允许在数小时内完成分离，即使没有超速离心机。当无机粒子涂有特定类型的聚合物时，可使用相同类型的较长链聚合物形成梯度（例如PEG、PVP）。当受离心速度限制时，较低密度的聚合物粒子要么通过延长离心时间和小密度梯度（这限制了粒子分离的范围）来分离，要么通过给粒子增加重量以增加总体粒子/簇密度来分离。这可以通过形成包含较高密度无机成分的聚合物簇或通过用聚合物材料包覆较重、较高密度的粒子核来完成。更常见的是，非吊桶式超速离心机中离心速度的限制通过分离较大粒子来克服。

2.6 非传统密度梯度离心

离心管内的梯度分布可修改为在离心管内包含反应区。当粒子通过离心管时，可在靠近梯度顶部的反应区进行修饰，然后在离心进行时分离。粒子在反应区停留的时间可控，使得能够在单次离心运行中同时研究反应机制和粒子分离。Zhang等人研究了金和银之间的电偶置换反应机制。他们在6步20-70%乙二醇/水梯度的第二步中引入一定量试剂。三角形银纳米片的尺寸决定了其在反应区的暴露时间，剩余的梯度实现了粒子尺寸的分离。组合方法使他们能够将表面反应的结构演变分为两个阶段。反应区还可用于引发粒子的受控聚集（引入高盐组装区，降低静电排斥）或异质组装（具有小带相反电荷粒子的区域，较大粒子穿过该区域）。反应区还可用于封装通过其的粒子。梯度离心的另一种方法是利用梯度介质的亲水性。具有极高胶体稳定性的粒子可能对超速离心构成挑战，特别是当意图分离这些样品中的不同群体时。Deng等人使亲水性粒子在微疏水性介质中聚集，然后通过增加的亲水性梯度离心。簇在离心过程中解离，并且由于每个群体具有略微不同的亲水性，不同粒子群体得以分离。

2.6.1 用于分析方法

密度梯度原理可转移到球坐标系，圆盘垂直旋转。密度梯度在盘内形成，盘边缘由检测器监测，随时间测量光吸收。多群体样品在通过梯度时分离，不同粒子群体在不同时间到达检测器。给定粒子密度和折射率，散射光可转换为粒子分布。这些分析离心装置基于与试管和区带转子中密度梯度离心相同的原理，但当存在多个粒子群体时，它们可提供高度准确的粒子信息。该技术不仅已用于确定均匀密度粒子的尺寸或密度，还显示分析离心可区分纳米粒子的表面结构。他们可区分纳米粒子水平的表面性质，并通过pH驱动的沉降获得表面特征的进一步见解。使用这些性质，可通过理论模型评估粒子电荷分布。分析离心的另一个应用是表征微孔微粒。他们用粒子内部较低的流体密度来解释分析离心中的沉降。这种方法使他们能够确定液体介质中的尺寸和粒子孔隙率。另一组在簇状粒子密度梯度离心方面进行了广泛工作，表明分析离心可近似非球形粒子簇的沉降系数。实验和模拟结果与使用的多种近似方法一致。

1. 3.
   结论
   具有窄尺寸分布的纳米粒子对于基础研究和实际应用都至关重要，因为它们的许多物理、化学、光学、磁性和生物性质强烈依赖于尺寸。宽的粒子尺寸分布可导致异质性行为、重现性降低以及在催化、药物递送、等离子体学和电子学等应用中性能下降。此外，单分散纳米粒子群体能够实现更可靠的表征，促进结构-性能关系的建立，并提高制造中的批间一致性。因此，能够按尺寸和密度分离纳米粒子的合成后纯化方法（如密度梯度离心）已成为获得高质量、窄分布纳米材料不可或缺的工具。一旦粒子被分离，通常使用额外的表征技术进一步检查并确认分离的有效性。通常电子显微镜是优选方法，因为它允许可视化粒子。然而，也已使用各种光谱技术，如光致发光、荧光和紫外-可见光谱，因为量子点、钙钛矿粒子和金纳米粒子等粒子的光谱取决于其尺寸，并可作为其特征指纹。密度梯度离心仍然是精确分离纳米和胶体粒子系统的关键技术。其多功能性实现了基于粒子尺寸、形状和密度的有效分离，解决了跨各种科学和工业应用中实现粒子均匀性所固有的挑战。虽然差速、等密度和速率区带离心方法各有优缺点，但理解其基本原理和操作细微差别有助于明智地选择方法和优化方案设计。此外，仔细考虑离心机设置、粒子-介质相互作用和梯度介质组成显著影响分离结果。通过利用本综述的见解，研究人员可驾驭粒子离心的复杂性，在实验室规模上实现可重现、可靠和高质量的分离。