《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Molecular mechanisms of YZG-331 ameliorated insomnia based on the gut microbiota–drug interaction
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肠道菌群在药物疗效和代谢研究中发挥着至关重要的作用。YZG-331表现出显著的镇静和催眠作用。然而，YZG-331在雌性小鼠中的口服生物利用度仍然较低，仅为27.7%，并且在肠道菌群中表现出不稳定性，经历快速代谢，其中肠道水解代谢产物M2被鉴定为特征代谢产物。
肠道菌群在药物疗效和代谢研究中发挥着至关重要的作用。YZG-331表现出显著的镇静和催眠作用。然而，YZG-331在雌性小鼠中的口服生物利用度仍然较低，仅为27.7%，并且在肠道菌群中表现出不稳定性，经历快速代谢，其中肠道水解代谢产物M2被鉴定为特征代谢产物。YZG-331对失眠的治疗作用及其涉及肠道菌群的酶介导代谢途径的潜在机制仍未完全阐明。在本研究中，研究人员发现YZG-331通过肠道菌群调节色氨酸代谢和5-羟色胺(5-HT)的生成途径。具体而言，YZG-331增加了肠道内乳杆菌属和鼠杆菌科的丰度，其中罗伊氏乳杆菌在YZG-331的代谢过程和色氨酸衍生代谢产物的生物合成中发挥着关键作用。YZG-331增强了四氢生物蝶呓(BH4)辅因子系统的激活，随后促进了色氨酸羟化酶(TPH)的活性，从而增强了5-HT的产生。此外，YZG-331和M2增加了肠道丁酸水平，从而促进睡眠调节并支持肠道屏障的恢复。总体而言，本研究首次提供了证据，突出了肠道菌群在YZG-331治疗失眠的机制和代谢处理中的关键作用。
失眠作为一种常见的睡眠障碍，其患病率逐年上升，且在女性群体中发生率更高。长期失眠不仅严重影响生活质量，还与肥胖、抑郁、心血管疾病及肠道损伤等诸多健康问题密切相关。临床研究表明，失眠患者普遍存在肠道菌群失调，且益生菌干预能够改善失眠症状，这提示肠道菌群的平衡在失眠的进程与治疗中扮演着关键角色。近年来，肠道菌群在药物代谢与药理研究中的重要性日益凸显，尤其是其通过“肠-脑轴”产生短链脂肪酸、γ-氨基丁酸(GABA)及色氨酸代谢产物等关键介质，进而调节大脑发育与功能的作用备受关注。传统中药在纠正菌群失调与改善睡眠障碍方面展现出独特优势。YZG-331作为一种天然产物衍生化合物，是天麻中主要活性成分N6-(1-苯基丙基)腺苷的优化衍生物。前期研究证实YZG-331是多靶点药物，不仅通过激活腺苷A1和A2受体改善失眠，还能通过增强下丘脑谷氨酸脱羧酶活性及GABA水平发挥镇静催眠作用，且已获准开展I期临床试验。然而，药代动力学研究显示其在雌性小鼠的口服生物利用度仅为27.7%，少数药物能透过血脑屏障，更多药物分布在胃肠道中；同时，YZG-331在肠道菌群中极不稳定，易被快速降解为特征代谢产物M2。由于YZG-331对肠脑轴代谢通路的药理机制及具体酶促反应过程尚不明确，研究人员开展了本研究，旨在阐明YZG-331与肠道菌群的双向相互作用机制，为其临床应用提供理论支撑。该研究成果已发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》。
在研究方法与技术方面，研究人员构建了多种小鼠失眠模型以开展体内药效评价，其中包括对氯苯丙氨酸(PCPA)诱导的失眠模型及慢性束缚应激结合PCPA的联合模型，并选用雌性BALB/c小鼠作为实验对象。为探究肠道微生态的作用，研究人员构建了伪无菌(PGF)小鼠模型及人源化无菌小鼠模型，后者需从不干预临床试验中获取失眠患者与健康志愿者的粪便样本并移植至无菌小鼠体内。基于上述队列，研究人员综合运用了非靶向与靶向代谢组学技术对粪便、血清及脑组织进行分析，结合16S rRNA基因测序评估肠道微生态结构；采用空气压力扫描微探针基质辅助激光解吸电离质谱成像(MSI)技术对脑组织进行空间代谢组学定位；结合体内外代谢孵化实验、基因异源表达、分子对接及定量实时聚合酶链反应等关键技术，系统阐明了药物与菌群的互作机制。
研究结果部分具体如下：
YZG-331改善PCPA诱导的小鼠睡眠障碍并指向肠道色氨酸-5-HT特征
研究人员通过戊巴比妥钠诱导的睡眠实验，发现口服给药的YZG-331能够剂量依赖性地缩短睡眠潜伏期并延长睡眠持续时间，且口服给药的药效优于同等剂量的腹腔注射，证明肠道是其发挥药理作用的关键部位。对粪便和血清样本进行的非靶向代谢组学分析表明，模型组小鼠出现明显的代谢谱分离，而YZG-331干预显著逆转了这一变化。其中，色氨酸代谢通路发生显著扰动，YZG-331治疗组粪便中的色氨酸水平下调而5-羟色胺(5-HT)水平显著上调，血清中5-羟色氨酸(5-HTP)含量明显增加，且这些代谢物水平与睡眠持续时间呈强正相关。
靶向色氨酸代谢组学鉴定5-HTP/5-HT为YZG-331的主要响应代谢物
通过靶向定量分析色氨酸下游三大主要代谢分支，研究人员发现YZG-331主要调节肠道内吲哚途径及5-HT生物合成途径。在失眠模型小鼠中，粪便5-HT和5-HTP水平显著降低，而YZG-331干预后这两种代谢物浓度均得到显著回升。血清代谢组学同样证实YZG-331显著提升了5-HTP与5-HT水平，表明该药物通过促进色氨酸向5-HTP和5-HT的转化发挥治疗作用。
YZG-331治疗后脑组织代谢途径改变的空间代谢组学定位分析
利用空间分辨率为50 μm的MSI技术，研究人员对脑组织切片中的代谢物进行了精确定位。结果显示，失眠模型组小鼠脑内5-羟基吲哚及5-羟基吲哚乙醛等5-HT代谢中间体水平异常升高。而YZG-331治疗组则显著上调了海马体等区域的5-HT、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺水平。KEGG通路富集分析显示，差异代谢物主要富集于色氨酸代谢及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢通路，提示YZG-331通过“肠-脑轴”调节中枢5-HT水平与抑制性神经递质体系发挥疗效。
肠道菌群是YZG-331发挥药效的必要条件并与orexin A调节相关
在慢性束缚结合PCPA诱导的失眠模型中，研究发现清除肠道菌群后，YZG-331延长睡眠持续时间的作用被显著削弱，同时伴随脑内与外周5-HT与5-HTP水平的下降，这证实地肠道菌群对于药物激活色胺酸-5-HT通路至关重要。机制层面上，YZG-331显著上调脑内5-HT1A与5-HT7受体表达，并下调促觉醒的下丘脑分泌素A及受体Hcrtr2表达。针对特征代谢产物M2的单独干预虽对整体5-HT影响不显著，但同样能有效改善睡眠，且该作用依赖于正常肠道菌群的存在。研究确认，M2通过显著促进肠道内丁酸的增加，进而调节下丘脑orexin A水平与睡眠进程，并具备改善神经炎症与神经保护功能。
YZG-331恢复肠屏障和炎症并伴随短链脂肪酸的恢复
病理学分析显示，失眠引发严重的结肠上皮屏障受损及炎症浸润，而YZG-331能有效修复紧密连接蛋白表达、改善粘膜水肿并降低TNF-α等促炎因子。FITC-葡聚糖渗透性实验确证了YZG-331对肠屏障功能的保护作用，该效应在PGF小鼠中被显著逆转。同时，通过体内外孵化实验证明，YZG-331及其代谢物M2可显著上调丙酸、丁酸和戊酸等短链脂肪酸的含量。
YZG-331缓解失眠相关的肠道菌群失调并富集色氨酸代谢相关微生物
16S rRNA测序结果表明，失眠导致厚壁菌门/拟杆菌门比例发生改变及Alpha多样性下降，而YZG-331能够显著重塑菌群结构，特异性增加有益菌群罗伊氏乳杆菌和Muribaculaceae的丰度。体外共培养实验证实，YZG-331不仅促进罗伊氏乳杆菌生长，还能进一步增强该菌种加速色氨酸代谢及5-HT合成能力。
肠道菌群介导YZG-331生物转化并鉴定参与M2形成的微生物酶
体外厌氧孵化表明，YZG-331在肠道菌群中通过快速水解和羟基化进行生物转化，其代谢远快于肝脏组织代谢。利用质谱在体内外鉴定出包括M1至M5在内的多种代谢产物。通过单菌株孵化筛选发现，罗伊氏乳杆菌具有高效的YZG-331降解能力。研究人员通过基因克隆构建表达体系，证实来源于罗伊氏乳杆菌的核糖核苷水解酶能够有效特异性催化YZG-331水解生成特征产物M2。
YZG-331通过羟基化反应促进5-HT生成的机制
在揭示肠道菌群水解YZG-331的同时，研究发现其另一条羟基化代谢通路在调节微生态代谢中起关键作用。实验验证，YZG-331的羟基化反应产生了质子，有效驱动二氢生物蝶呓(BH2)还原为四氢生物蝶呓(BH4)。作为关键辅因子，提高的BH4激活了色氨酸羟化酶(TPH)的生物活性，从而加速色氨酸向5-HTP并最终向5-HT的转化。通过使用羟基化抑制剂和BH4合成抑制剂的抑制实验及细胞模型证实，阻断羟基化途径将导致BH4-TPH级联通路受阻，进而消除5-HT生成与神经受体激活效应。
YZG-331在人源化菌群小鼠模型中保持治疗功效
为验证转化医学意义，研究利用失眠患者粪便移植建立人源化无菌小鼠模型。结果显示，接受失眠患者菌群的小鼠表现出明显的睡眠障碍特征及色胺酸代谢物降低。给予YZG-331治疗后，不仅显著改善了小鼠的睡眠指标，提升了体内5-HT水平，同时还能部分纠正微生态群落异常，提高乳杆菌属等有益菌丰度，确证了肠道菌群-色氨酸-5-HT轴在人类相似生理环境下的可响应性。
在总结与讨论部分，研究人员深入剖析了YZG-331通过依赖肠道菌群的“肠-脑轴”双向调节机制。一方面，YZG-331作为多靶点药物，在通过血脑屏障直接作用于中枢神经系统经典神经递质系统的同时，通过重塑肠道菌群结构，特别是促进罗伊氏乳杆菌等有益菌株的增殖，加速肠道内色氨酸向5-HT转化；另一方面，肠道菌群表达特异性酶对药物进行生物转化，水解生成的代谢产物M2通过促进短链脂肪酸特别是丁酸的产生，修复肠道屏障并抑制炎症，同时通过调节下丘脑神经肽orexin系统协同改善睡眠。此外，菌群对药物的羟基化代谢反应间接介导辅因子BH4的累积，从而驱动限速酶TPH加速神经递质合成，形成中枢与外周协调互作的复杂多机制网络系统。该研究不仅阐明了YZG-331依赖微生态发挥催眠功效的分子基础，为临床精准用药和微生态干预策略提供了重要的理论依据，同时也揭示了菌群来源的特定水解酶在天然腺苷衍生物体内代谢命运中的决定性作用。
