双稳定同位素标记揭示土壤食物网中隐蔽的捕食者-猎物关系

《SOIL BIOLOGY & BIOCHEMISTRY》：Dual stable isotope labelling disentangles cryptic predator-prey relationships in the soil food web

　　

土壤捕食性螨类（Mesostigmata）的生物防治贡献了重要的生态系统服务，但其在复杂土壤环境中的猎物选择和营养角色仍知之甚少。例如，功能不同的线虫类群，即自由生活线虫（free-living nematodes, FLN）和植物寄生类群，是许多土壤捕食螨的食物。研究人员在短期盆栽试验中应用了双稳定同位素标记方法来追踪这些营养相互作用。评估了四种营养情景：单独捕食螨（对照）、螨类与自由生活线虫（FLN + mites）、螨类与根结线虫（RKN + mites）以及螨类与两组线虫同时存在（FLN + RKN + mites）。细菌食性的FLN Acrobeloides bodenheimeri 的 13C 信号是通过实验开始时对盆栽生菜进行 13CO2 标记实现的。大量培养 15N 标记的根结线虫（root-knot nematodes, RKN）Meloidogyne incognita 是通过用 15N 标记的 Ca(15NO3)2 和 K15NO3 施肥感染番茄获得的。使用未标记线虫的相同处理作为同位素对照。双同位素标记允许在半天然土壤条件下追踪螨类 Protogamasellopsis zaheri 的膳食选择。当仅有FLN可用时，螨类掺入了 13C；当仅有RKN可用时，掺入了 15N；当两种猎物类型共存时，表现出明显的FLN膳食偏好。此外，在含有标记生菜但无线虫的处理中，13C 富集表明存在替代的与根际相关的碳途径。总体而言，在中型动物捕食者饮食中加入两种不同的同位素信号，可以识别所消耗特定猎物的相对数量和组成。这证明了双同位素标记在揭示隐蔽生态系统中无法通过原位检测到的营养联系方面的强大能力。

该研究发表于《SOIL BIOLOGY》。研究背景方面，土壤食物网是复杂的生态网络，其中营养相互作用驱动着养分循环、植物健康和害虫抑制等生态系统功能。捕食性螨类（Mesostigmata）作为土壤食物网中的关键生物防治因子，捕食多种土壤生物，其杂食性程度高，能通过捕食影响碳和能量转移从而有助于植物健康。然而，由于土壤系统的固有难度，对中气门螨类（Mesostigmata）食性的了解受到限制，传统方法如分析肠道内容和粪便及直接观察摄食因个体微小且在土壤基质中难以检测而不切实际且繁琐。大多数营养关系数据基于受控条件下的实验室观察或间接从种群和植物水平响应推断，导致营养类群主要依据形态学或摄食实验分配，反映分类学多于功能。尽管近期分子肠道内容分析和稳定同位素研究显示跨多个营养水平的摄食，但关于中气门螨类在天然或半天然条件下消耗特定猎物的相对数量和组成的直接数据仍然匮乏，尤其对于稀有和难以捉摸的物种存在显著知识缺口。线虫作为土壤中最丰富多样的类群之一，是捕食螨的重要食物，占据从贡献有机物分解和矿化的自由生活线虫（FLN）到威胁作物生产力的植物寄生种如根结线虫（RKN）的广泛生态位。FLN被证明能增强螨类适应度和繁殖力，被视为改善螨类对农业害虫控制的补充猎物，但这些仅是间接观察基于螨类繁殖发育及减少害虫效应和改善植物产量，未针对直接捕食者-猎物相互作用。线虫脂质含量和脂肪酸谱因功能群和物种而异影响其对捕食螨的营养价值，且对螨类适应度的影响并非跨物种一致。有趣的是，尽管南方根结线虫（M. incognita）营养价值中等，P. zaheri 即使在更有营养的猎物可用时仍能控制植食性RKN，表明捕食螨的调节行动不仅由猎物营养质量决定，可能反映更广泛的一般捕食者摄食策略及物理接近等因素。土壤食物网通过基底资源与土壤动物间复杂营养相互作用调节碳（C）和氮（N）循环，稳定同位素比值（δ¹³C 和 δ¹⁵N）分析已成为推断营养相互作用的有力工具，天然变异提供消费者-资源关系的间接证据，如营养转移中 δ¹⁵N 富集及反映基底资源利用的较保守 δ¹³C 特征。植物 ¹³CO₂ 脉冲标记用于追踪受控和田间条件下土壤食物网内碳流，近期双稳定同位素标记（¹³C 和 ¹⁵N 富集）用于短期田间试验追踪养分从基底资源向土壤中型大型动物的转移，但土壤条件下共存猎物矩阵内的个体营养联系（即猎物选择）仍探索不足。不同稳定同位素可通过猎物获取食物的途径纳入不同猎物群，如植物 ¹³C 脉冲标记可追溯 rhizosphere 食物网碳转移，而 ¹⁵N 富集肥料土壤改良剂可通过植物组织氮吸收标记根食者。本研究调查常见捕食螨 P. zaheri 在半天然土壤环境中以两种线虫功能群（细菌食性FLN和植物寄生RKN）觅食的膳食选择。FLN通过 ¹³CO₂（99 at%）脉冲标记生菜植株的根际土壤获得 ¹³C 信号，RKN通过在施用了Ca(¹⁵NO₃)₂ 和 K¹⁵NO₃（10 at%）的番茄植株根系取食获得 ¹⁵N 信号。研究有两个主要目标：一是评估双同位素标记（¹³C 和 ¹⁵N）是否比天然同位素变异更能改善识别当前猎物及解析土壤条件下捕食螨难以检测的营养联系，假设结合两者会增加猎物源间同位素分离增强营养分辨率；二是确定广义捕食螨 P. zaheri 同时暴露于FLN和RKN时的初始膳食选择，假设即使有营养更优的FLN可用，捕食螨仍会消耗RKN，可能从其相互作用开始就对植物寄生线虫种群动态产生负面影响。

为开展研究用到的主要关键技术方法包括：根结线虫（Meloidogyne incognita）的 ¹⁵N 标记培养技术，通过在易感番茄品种上繁殖并在接种二十天后改用 ¹⁵N 标记的霍格兰氏溶液（Hoagland’s solution）施肥使线虫获得 ¹⁵N 标记；生菜移植与细菌食性自由生活线虫（Acrobeloides bodenheimeri）培养及 ¹³C 标记技术，通过对移栽两周的生菜进行99 at% ¹³CO₂ 脉冲标记四小时将 ¹³C 信号引入FLN；土壤捕食螨（Protogamasellopsis zaheri）的实验室群落维持与饥饿处理；设置四种处理（单独螨类对照、FLN+螨类、RKN+螨类、FLN+RKN+螨类）及其相应未标记同位素对照的完全随机设计盆栽实验；采用改进的白曼漏斗（Baermann funnel）和贝尔莱斯漏斗（Berlese funnel）分别提取线虫和螨类；利用元素分析仪耦合稳定同位素比值质谱仪测定 ¹³C/¹²C 和 ¹⁵N/¹⁴N 比值并以δ notation表达，计算过量 ¹³C 和 ¹⁵N 及观察营养富集（ΔδX）；应用贝叶斯同位素混合模型（MixSIAR）估算FLN和RKN对螨类饮食的贡献比例；使用GAMLSS模型及emmeans包在R语言中进行同位素特征统计比较。

研究结果部分保留小标题并说明如下。3.1. δ¹⁵N 和 δ¹³C 天然同位素对照与标记处理的信号。在天然同位素条件下，土壤、生菜、FLN、RKN和螨类各营养区室间存在明显δ¹³C和δ¹⁵N特征，土壤δ¹⁵N最低，FLN作为次级分解者天然富集δ¹³C和δ¹⁵N，螨类捕食者比FLN饮食增加约2‰ δ¹⁵N，RKN天然信号明显分离，天然螨类信号在有/无RKN处理中大量重叠而在仅有FLN时与植物组织相关。标记后 ¹⁵N 和 ¹³C 成功纳入目标源，两种线虫饮食及土壤植物组织的同位素区分更显著。土壤δ¹³C富集21.1±0.3‰，生菜根系富集1305–1861‰（均值Δ¹³C 1581.1±7.8‰），叶片富集1325–2024‰（均值Δ¹³C 1615.9±7.1‰），FLN δ¹³C增加85至690‰（均值Δ¹³C 276.5±17.3‰）。标记处理中螨类反映各自饮食同位素富集：仅 ¹⁵N 标记RKN时螨类δ¹⁵N富集64.4±19.9‰，仅 ¹³C 标记FLN时δ¹³C富集124.7±26.9‰，两者共存时螨类主要掺入 ¹³C（Δ¹³C 106.5±16.9）而有限掺入 ¹⁵N（Δ¹⁵N 8.4±3.0）。

3.2. 营养联系。天然同位素变异中FLN相对于土壤和生菜根部分别显示约4和2‰的Δ¹⁵N，螨类相对于土壤和根部富集超过4‰，相对于FLN约2‰，但相对于RKN组织δ¹⁵N耗减约4‰。FLN和螨类的Δ¹³C相对于土壤和生菜根约3.5和3‰，螨类信号接近FLN略耗减，与RKN的Δ¹³C分离超5‰。双标记下仅RKN存在时螨类δ¹⁵N富集11至121‰，仅FLN时δ¹³C富集37至240‰，确认独立接种时捕食各自猎物。两者共存时螨类主要掺入 ¹³C（52.6–249.7‰ δ¹³C）而低同化 ¹⁵N（-2.7–28‰ δ¹⁵N），表明明显偏好FLN。仅接种RKN处理中也观察到轻微 ¹³C 富集（11.6–29.6‰），但与天然变异或无FLN处理无显著差异。

3.3. FLN和RKN对螨类饮食的贡献。考虑天然δ¹⁵N和δ¹³C变异，贝叶斯混合模型估计FLN贡献近90%（95% CI: 68.3–99.0%），RKN约12.3%（95% CI: 0.5–27.8%）。用标记处理数据拟合模型时FLN贡献增至99%以上（95% CI: 99.5–100%），RKN降至1%以下（95% CI: 0.1–0.5%）。天然变异残差项ε为δ¹³C 4.5±4.4‰和δ¹⁵N 7.0±5.1‰，标记处理中δ¹³C残差较低（2.2±2.9‰）而δ¹⁵N较高（16.1±5.1‰）。

讨论部分总结如下。4.1. 双稳定同位素标记追踪营养相互作用。研究表明结合δ¹³C和δ¹⁵N稳定同位素标记比天然同位素变异提高营养分辨率，能区分共存土壤生境中密切相关的线虫猎物，克服常限制分辨率的同位素特征重叠。与仅基于天然丰度信号系统不同，¹³C和¹⁵N标记提供足够分离以解开捕食者与猎物间二元联系。在基底资源引入独特同位素信号并传递至下一营养级草食者和次级分解者，该特征在转移至捕食者后仍可区分。类似地他人观察到双同位素标记允许追踪自然条件下各种基底资源至土壤中型动物的养分流，使得仅用批量稳定同位素分析就能深入调查原位二元营养联系，通常需结合生物标志物分子如脂肪酸或氨基酸。生菜生物量 ¹³CO₂ 脉冲标记及相关 ¹³C 转移至根际使根际微生物牧食者同位素标记，而植物 ¹⁵N 施肥使根相关草食者获特定信号，从而区分土壤两大食物链即草食（绿色）和腐食（棕色）链。FLN通过标记生菜根分泌物快速掺入 ¹³C，Δ¹³C 高于天然变异12倍且与RKN有超200‰同位素差异；RKN J2在植物施肥两个月后掺入 ¹⁵N 超200倍富集（Δ¹⁵N）且与FLN差3000‰。首次显示用Ca(¹⁵NO₃)₂ 和 K¹⁵NO₃ 施肥植物导致RKN第一代（F1）J2通过母体取食 ¹⁵N 标记根系而同位素标记，因J2是所有定居内寄生线虫唯一移动阶段在土壤中自由迁移，这为未来营养相互作用及生物害虫防治研究形成重要基础。总之双同位素标记（δ¹³C 和 δ¹⁵N）是被证可靠的监测复杂环境下营养相互作用方法以解开二元联系并估算猎物偏好及相对贡献，可与分子工具结合减少污染假阳性、检测同类相食或最小化捕食者DNA扩增偏差。

4.2. 捕食者-线虫猎物相互作用：营养联系证据与选择性摄食。结果部分支持第二个假设即相互作用开始时螨类在FLN同时存在时仍将RKN纳入饮食：单独提供RKN时消耗，但FLN存在时摄食极少。¹³C和¹⁵N掺入螨类组织证实对两类线虫功能群的捕食，突显螨类作为土壤食物网中自上而下的调节者。但有选择时 P. zaheri 明显偏好FLN而非RKN（由 ¹³C 信号指示），贝叶斯混合模型确认天然同位素变异下螨类饮食超90%为FLN，双标记下超99%。此处估计饮食贡献反映初始5天相互作用而非完全同位素平衡，且不同螨类间 ¹³C 富集变异可能反映实验短时长（5天）及同位素特征依赖近期未完全同步摄食事件，个体摄食模式差异及猎物遭遇率可致捕食者间异质同位素掺入。无脊椎动物同位素周转通常5–10天内发生，表明观察的同位素特征反映当前饮食。假设捕食螨掺入速率也快，因短期内观察到产卵、存活和生物量的快速变化。结果与先前研究表明许多中气门目（Mesostigmata）物种以微食线虫为食，主要通过土壤食物网分解者渠道获取碳和能量一致，捕食螨与草食渠道的联系知之较少因多在天然少干扰生态系统进行。但农业系统应受关注，因活植物组织消费者如植物寄生线虫种群在此高得多。短期实验室和半天然研究表明替代食物源常减少对焦点的捕食，尤其当营养利于发育繁殖时；长期研究涉及多样猎物或持续替代猎物接触揭示广义螨类可调节猎物种群尤其在超过其世代时间尺度上。本5天研究可能未捕捉长期动态如补偿性摄食或捕食者种群数值响应，例如104天实验报道 P. zaheri 与FLN（R. axei）处理提高番茄产量并降低 M. incognita 种群，尚待确定长期种间相互作用是否因捕食者种群数值响应或营养依赖的饮食调节导致RKN捕食增加。此外植物寄生虫调节受植物–微生物–线虫–捕食螨间接多营养相互作用影响。初始猎物选择不仅由营养价值决定还可能受猎物行为和空间动态等因素影响。M. incognita J2表现向根定向运动，有利土壤条件下每日达3–16 cm，实验中虽螨类和RKN同时在土壤表面释放，但移液管接种J2可能借水流移至土壤深层使其快速定位和进入根部从而限制捕食机会，这也解释实验结束未回收RKN J2的原因；相反FLN同样移液但留在土壤基质中增加与捕食螨遭遇机会，因此线虫流动性和行为可能调节捕食者-猎物相互作用强度。

4.3. 捕食螨 P. zaheri 的稳定同位素掺入。P. zaheri 天然同位素组成表明相对于土壤、植物组织和FLN猎物的营养富集，与土壤食物网预期分馏一致。δ¹⁵N 每营养级3.0–3.5‰富集典型，但基于碎屑系统 ¹³C 变异更大且Δ¹³C值通常低并随基底资源和微生物处理变化。研究中 P. zaheri 相对于土壤和根部δ¹⁵N富集4–6‰，相对于FLN约2‰，支持其作为次级消费者角色。天然变异中 P. zaheri 相对于RKN的δ¹⁵N耗减而非富集，与RKN ¹⁵N 标记时尤其作为单一猎物提供的捕食证据相悖，先前研究也证实 P. zaheri 仅以 M. incognita 发育繁殖。这种分歧可能因具不同同位素特征的替代食物源影响螨类特征，这由接种RKN土壤与无线虫土壤螨类相似δ¹⁵N值支持。同样植物标记但无标记线虫猎物存在时（仅螨类对照处理）螨类δ¹³C富集也暗示替代碳源可能为根分泌物或根际微生物，虽然土壤中型螨可能取食真菌或腐食被认为罕见或机会性，迄今无Rhodacaridae螨取食真菌或其他微生物报道故该理论需进一步研究。此外消费者相对于其一食物源耗减在多猎物系统中不罕见，混合模型研究常报告捕食者介于源之间导致相对于一源富集而相对于另一源耗减，尤其当耗减源是饮食主要贡献者时。天然变异中 ¹³C/¹²C 信号分配碳流至不同土壤食物网区室，捕食螨相对于土壤和生菜根富集约3.0‰显示碳从基底资源转移，此δ¹³C富集是通过微生物中间体或根分泌物获取碳的土壤无脊椎动物特征，倾向于相对于枯枝落叶富集的现象称“碎屑偏移”（detrital shift）。另一方面捕食螨 P. zaheri 相对于FLN轻微δ¹³C耗减及相对于RKN高富集也可能支持上述假设即螨类并非从两线虫猎物获取所有碳，还从具较低δ¹³C特征的其他源如真菌生物质获取。

结论部分翻译如下。双稳定同位素标记的应用为解开土栖营养相互作用提供了有力工具。通过同时追踪两种不同类型猎物，该方法在识别否则隐藏的营养联系方面提供更高分辨率。因此证明适用于理解和量化天然或半天然条件下中气门螨类（Mesostigmata）饮食组成，并能解开隐蔽食物网中密切相关功能群或类群的捕食者-猎物偏好。此方法提高了表征土壤食物网中饮食组成和营养途径的能力，而不仅依赖间接的基于性能的衡量。此外该应用可轻易用于其他螨类猎物如农业害虫蓟马或蝇，并用于生物防治研究。应用此方法时需特别注意实现猎物源间充分同位素分离、选择适当宿主-猎物系统以有效掺入标记，并考虑土栖环境中相互作用生物及同位素同化的时空变异性。本研究证实微生物食性线虫是 P. zaheri 等捕食螨饮食的重要组成部分，突显微生物基底资源在土壤营养和能量流向更高营养级的重要性。尽管RKN较少被靶向，但其存在仍可能贡献螨类营养或在不同猎物可用性背景下变得相关。结果表明土壤捕食者-猎物相互作用不仅由猎物营养价值决定，还受包含间接相互作用和更广泛基底资源（如植物组织、微生物）给土壤动物捕食者如螨类的营养网络动态影响。