基于紫外共振拉曼光谱法评估水相核苷酸混合溶液中5-甲基胞苷的存在

《ACS Applied Optical Materials》：Evaluation of 5-Methylcytidine Presence in Aqueous Nucleotide Mix Solutions by Means of Ultraviolet Resonant Raman Spectroscopy

　　

测定DNA中胞嘧啶甲基化水平对于理解表观遗传调控及其与疾病的关联至关重要。本项初步研究检验了紫外共振拉曼（UVRR）光谱作为一种无标记方法，用于在模拟基因组DNA的水相核苷酸混合物中检测并测量5-甲基脱氧胞苷三磷酸（5-me-dCTP）的适用性。研究人员记录了266、244和226 nm下的UVRR光谱，以考察激发波长和甲基化水平如何影响胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的振动特征。作为补充，研究还开展了紫外-可见吸收测量以及基于胞苷和5-甲基胞苷的密度泛函理论（DFT）模拟，用于阐明电子跃迁并支持振动峰归属。研究识别出甲基化标志，尤其包括266 nm下1363 cm^–1谱带，以及244和226 nm下约1523和1670 cm^–1的谱带；这些谱带的相对强度随胞嘧啶甲基化水平发生系统性变化。在所测试波长中，226 nm激发（同步辐射光源）通过最小化腺嘌呤和鸟嘌呤的贡献，对胞嘧啶相关振动提供了最高灵敏度和选择性。补充性的衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）测量提供了非共振振动视角，揭示了核碱基与磷酸骨架的贡献。联合UVRR与FTIR分析表明，UVRR能够选择性检测胞嘧啶甲基化，而FTIR则为整个核苷酸体系提供互补的结构信息，并可作为DNA提取质量检查手段。这些结果确立了UVRR光谱作为一种有前景的、快速且无损的方法，可在近生理条件下检测DNA甲基化。

该文发表于《ACS Applied Optical Materials》，围绕DNA胞嘧啶甲基化的光谱检测展开。胞嘧啶C5位甲基化是重要的表观遗传修饰，与基因表达调控、CpG岛启动子沉默以及肿瘤等疾病发生密切相关，因此建立快速、无标记、接近生理条件的甲基化检测策略具有明确的生物医学意义。现有DNA甲基化检测方法包括重亚硫酸盐转化、表面增强拉曼散射（SERS）和多类光学分析手段，但在样品前处理复杂性、标记依赖性、对原位水相条件兼容性以及对碱基本征化学信息的选择性方面仍存在限制。紫外共振拉曼（UVRR）光谱可通过电子共振优先增强核碱基振动，而核糖与磷酸基团信号较弱，因此理论上尤其适于胞嘧啶化学状态分析。与此同时，傅里叶变换红外（FTIR）虽不具备共振选择性，却能提供包括核碱基、脱氧核糖和磷酸骨架在内的整体振动信息，并可用于核酸完整性和提取质量评估。基于此，研究人员开展了针对受控水相核苷酸体系的试点研究，以建立胞嘧啶甲基化UVRR定量分析的基础，并评估不同激发波长的检测效能。

为解决这一问题，研究人员以dATP、dGTP、dTTP、dCTP和5-me-dCTP构建模拟基因组碱基组成的水相核苷酸混合体系，通过改变胞嘧啶核苷酸中5-me-dCTP的摩尔比例，考察甲基化水平变化是否会引起UVRR谱线形改变。研究同时对单独的dCTP和5-me-dCTP水溶液进行266、244和226 nm激发下的UVRR测量，以建立峰归属基础；并辅以紫外-可见吸收测试和基于胞苷、5-甲基胞苷的含时密度泛函理论（TD-DFT）及共振拉曼计算，解析电子跃迁与共振增强行为。此外，研究还采集了dCTP和5-me-dCTP的ATR-FTIR光谱，用以从非共振角度比较甲基化前后的全分子振动特征。综合实验与理论结果，研究人员证实UVRR可识别5-me-dCTP相关特征带，且226 nm激发对胞嘧啶相关振动最具选择性；ATR-FTIR虽然选择性较弱，但能提供骨架与碱基整体结构信息，并适于DNA质量控制。该研究的重要意义在于为近生理条件下DNA甲基化的快速、无损、无标记检测提供了光谱学依据，并明确了UVRR与ATR-FTIR在选择性检测与全局结构表征中的互补关系。

研究所采用的主要技术方法可概括如下：其一，构建含dATP、dGTP、dTTP、dCTP和5-me-dCTP的水相核苷酸混合物，设置胞嘧啶核苷酸中5-me-dCTP摩尔比为0、0.5和1.0，并制备dCTP与5-me-dCTP单组分对照溶液；其二，在Elettra同步辐射装置IUVS光束线进行266、244和226 nm紫外共振拉曼（UVRR）测量，比较不同激发波长下的光谱响应；其三，采用紫外-可见吸收光谱与基于Gaussian 16的密度泛函理论（DFT）/含时密度泛函理论（TD-DFT）计算，对胞苷与5-甲基胞苷的电子跃迁和振动模式进行模拟；其四，在SISSI-Bio光束线采集衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱，以获得非共振条件下核苷酸整体结构信息。本文未涉及生物样本队列。

一、UV–Visible Absorption of dCTP and 5-me-dCTP
研究人员首先比较了dCTP与5-me-dCTP的紫外-可见吸收光谱，并将实验结果与脱氧胞苷及5-甲基脱氧胞苷的TD-DFT模拟消光系数叠加对照。结果表明，两种理论方法均略低估吸收峰位置，但aug-cc-pVDZ基组结果更接近实验值。对于脱氧胞苷，模拟的230 nm跃迁与实验特征相符，而261.45 nm跃迁相较实验271 nm峰出现蓝移；5-甲基脱氧胞苷也表现出类似蓝移。该部分结果说明，电子跃迁位置能够为后续不同激发波长下的UVRR共振行为解释提供依据，也提示三磷酸基团可能改变实际核苷酸的电子结构，使实验吸收行为与核苷模拟存在差异。

二、UVRR of dCTP and 5-me-dCTP
在dCTP的UVRR分析中，研究人员发现266、244和226 nm下均存在1651和1530 cm^–1两个强谱带，分别归属于NH₂剪式振动与C═O伸缩耦合，以及NH₂剪式振动与C–N伸缩耦合。相较之下，1450 cm^–1以下多个谱带对激发波长更敏感，其相对1651和1530 cm^–1带的强度会随激发波长增加而减弱，这与模拟结果一致。对于5-me-dCTP，1667、1527和1491 cm^–1等特征带呈现不同于dCTP的波长依赖性，尤其1491 cm^–1宽峰在266 nm时显著、在244和226 nm时减弱并并入1527 cm^–1带。1450 cm^–1以下的1363、1305、1262和1224 cm^–1等谱带也显示出明显的激发波长依赖，其中1363 cm^–1带在266 nm时较强、244 nm减弱、226 nm消失。该部分研究通过单组分比较明确了甲基化引入后胞嘧啶振动模式及其共振行为的变化，为后续混合物中甲基化识别奠定基础。

三、ATR-FTIR of dCTP and 5-me-dCTP
为补充UVRR仅选择性增强核碱基振动的局限，研究人员进一步分析了dCTP与5-me-dCTP的ATR-FTIR光谱。结果显示，dCTP实验光谱在1300 cm^–1以上与脱氧胞苷模拟总体一致，而1300 cm^–1以下则受三磷酸基团振动主导，出现1242、1126、1090、981和905 cm^–1等典型磷酸振动带。对于5-me-dCTP，1400 cm^–1以上的模拟与实验同样较为吻合，而1400–1500 cm^–1区间由于CH₃弯曲振动与环振动重叠，对甲基化尤其敏感；约1485–1495 cm^–1附近峰形和强度变化构成胞嘧啶甲基化的红外特征。另一个显著差异位于2800–3000 cm^–1区间，该区主要反映甲基相关C–H伸缩振动。该部分结果表明，ATR-FTIR虽不如UVRR对胞嘧啶甲基化具有选择性，但能从碱基、糖和磷酸骨架整体层面提供互补结构信息，并可用于识别DNA损伤或提取残留污染物。

四、UVRR of Nucleotide Mix Solutions
在模拟基因组组成的核苷酸混合体系中，研究人员考察了不同甲基化比例对UVRR谱形的影响。266 nm下，混合物光谱主要由dATP及部分dGTP贡献主导，dCTP信号较弱，但由于5-me-dCTP在1363 cm^–1具有dCTP所缺失的特征带，因此随5-me-dCTP含量增加，该位置出现小但相关的强度变化。244 nm下，1363 cm^–1特征不再明显，但1525 cm^–1附近以及较弱的1670 cm^–1处出现可区分的强度差异；不过此波长下DNA样混合物光谱仍主要受腺嘌呤和鸟嘌呤影响，胞嘧啶贡献有限。226 nm下，光谱响应发生明显改变，胞嘧啶贡献成为主导，而腺嘌呤与鸟嘌呤信号显著降低；dCTP与5-me-dCTP间最显著差异集中于1523和1670 cm^–1，且混合物中这些位置的变化与5-me-dCTP比例增加一致。通过不同波长灵敏度定量比较，研究人员得出226 nm在抑制腺嘌呤和鸟嘌呤背景、增强胞嘧啶修饰检测方面最具优势，但同时指出谱信噪比（SNR）和分辨率仍是决定低甲基化水平检测能力的关键因素。

综合讨论部分可见，该研究的核心贡献在于系统比较了266、244和226 nm三种激发条件下，UVRR对胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶振动模式的响应差异，并通过理论计算与ATR-FTIR补充验证了关键谱带归属。研究显示，UVRR的共振选择性能够有效削弱核糖与磷酸骨架信号干扰，从而聚焦核碱基尤其是胞嘧啶相关振动；相比之下，ATR-FTIR虽谱图更复杂，但在核酸质量控制和全分子结构评估方面具有不可替代的辅助价值。文章同时强调，尽管226 nm在原理上具有最高灵敏度和选择性，但要充分利用这一优势，仍需高信噪比和更优光谱分辨率支持。因此，本研究不仅提供了胞嘧啶甲基化的候选光谱标志，也明确了今后由原理验证迈向复杂基因组DNA乃至临床样本应用时需要优化的关键实验条件。

研究结论部分可译为：本项初步研究表明，紫外共振拉曼（UVRR）光谱可用于定量分析水相核苷酸混合物中的5-me-dCTP，并具有纳摩尔级灵敏度。研究采用实验室激光与同步辐射，对266、244和226 nm三种激发波长进行了评估；其中，226 nm激发对胞嘧啶相关振动最具选择性，在1363、1523和1670 cm^–1处可为5-me-dCTP与未修饰dCTP提供最大对比。由B3LYP/aug-cc-pVDZ模拟支持的UVRR截面计算证实，增强灵敏度源于与核碱基电子跃迁的共振，从而有效抑制核糖和磷酸基团贡献。补充性的ATR-FTIR测量对胞嘧啶特异振动的选择性较低，但可对分子体系提供更全面的整体视图，这对于评估基因组DNA质量至关重要。两种技术均在1400–1700 cm^–1区域观察到与甲基化相关的振动特征，从而支持峰归属的稳健性；此外，ATR-FTIR还可通过2800–3000 cm^–1区间中与CH₂和CH₃伸缩振动相关的特征提供进一步甲基化信息。然而，UVRR能够提供更高的对比度和灵敏度，从而实现ATR-FTIR难以完成的定量分析。这项原理验证研究确立了UVRR作为一种快速、无标记技术，可在近生理条件下无需样品衍生化或复杂制备即可探测DNA甲基化。基于同步辐射的226 nm辐照可获得高信噪比与光谱分辨率，这对于区分细微甲基化差异至关重要。