pH依赖的二氧化硅纳米壳层降解对生物环境中表面增强共振拉曼散射（SERRS）增强的影响

《ACS Measurement Science Au》：pH-Dependent Silica Nanoshell Degradation Influences SERRS Enhancement in Biological Environments

　　

二氧化硅包覆的金纳米星（AuNStar-SiO₂）是一种广泛使用的等离激元纳米颗粒平台，用于表面增强共振拉曼散射（SERRS）。研究人员证明了耦合的纳米星亚群主导了悬浮液的系综平均SERRS响应，并且细胞培养条件足以使二氧化硅纳米壳层发生水解，从而在体外胞吞作用后引入信号强度的变异性。通过连续密度梯度离心分离出了单体和低聚物AuNStar-SiO₂组分，结果显示与低聚物对应物相比，单体纳米颗粒的SERRS显著较弱。使用富含单体的AuNStar-SiO₂，研究人员研究了在代表胞吞作用期间顺序酸化的条件下二氧化硅纳米壳层的稳定性，并表征了纳米颗粒光学特性的变化。在代表溶酶体pH值的酸性环境中，二氧化硅壳层是稳定的；而在细胞培养基中的近中性和碱性条件下，则引发了二氧化硅壳层的水解、纳米星的释放和颗粒间聚集，导致短暂的SERRS放大。然而，当细胞在近中性和酸性条件下用AuNStar-SiO₂处理时，观察到了SERRS信号呈现相反的趋势。在pH 7.4时，尽管细胞内纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像显示出二氧化硅水解程度的逐渐加深，但SERRS信号仍被抑制；而在pH 6.4时，SERRS信号很强，且细胞内纳米颗粒的二氧化硅壳层保持完好。总之，这些发现揭示了局部环境因素如何控制生物环境中的二氧化硅纳米壳层稳定性和SERRS信号输出。研究结果强调了二氧化硅水解在控制纳米颗粒性能方面以前未被充分认识到的作用，并指出了在生物医学应用的二氧化硅包覆等离激元探针设计中，有意利用或控制二氧化硅纳米壳层降解的新机遇。此外，由于二氧化硅壳层广泛用作结合靶向功能的连接层，这些发现提出了关于原位水解可能如何影响已建立的纳米颗粒系统中的关键纳米-生物相互作用的关键问题，包括靶向效率和胞吞摄取。

近年来，等离激元金纳米颗粒因其生物相容性和独特的光学性质，在生物医学成像和传感领域展现出巨大的潜力。当局部表面等离激元共振（LSPR）被激发时，这些颗粒能够在表面产生强烈的电场局域增强，从而促进表面增强拉曼散射（SERS）。结合报告分子的本征电子跃迁与局域电磁增强，表面增强共振拉曼散射（SERRS）进一步放大了拉曼信号。尽管此类纳米探针已被广泛应用于体外和体内的细胞内吞成像、受体结合定量及肿瘤切除术中的对比导航，但 heterogeneous（多相性）纳米颗粒系统中不同亚群对整体SERRS信号的相对贡献却鲜有被充分表征。进一步而言，虽然金纳米颗粒常被认为在细胞内吞后的溶酶体等酸性环境中相对惰性，但越来越多的研究证实其表面涂层（如广泛用于包覆的二氧化硅层）在进入生理环境后易发生显著的化学降解。目前，对于二氧化硅纳米壳层在生物环境中的具体稳定性，以及其在细胞 trafficking（转运）过程中发生水解后对等离激元光学特性和SERRS信号输出产生何种影响，学术界仍缺乏深入理解。为解决上述问题，研究人员对AuNStar-SiO₂亚群的信号来源进行了系统探究并发表了其研究成果于《ACS Measurement Science Au》。该研究深入阐明了局部环境pH值与纳米壳层稳定性之间的相互作用机制，揭示了二氧化硅降解在决定纳米探针性能中以往被忽视的关键角色，还对基于二氧化硅水解调控其体内清除潜力及提升靶向稳定性的新策略提出了重要见解，为定量生物医学成像提供了坚实的理论与实践基础。

在本研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法展开研究：首先通过连续密度梯度离心法对多相AuNStar-SiO₂悬浮液进行精细分离，以提取不同聚集态的颗粒亚群；随后，结合紫外-可见光谱、动态光散射（DLS）及透射电子显微镜（TEM）对各组分的光学特性、粒径及形貌进行系统表征；在模拟生理及内吞acidification（酸化）环境的不同pH值缓冲液中进行体外降解实验，并结合SERRS光谱实时追踪降解过程；在细胞实验队列方面，利用人结直肠腺癌细胞系（SW48）及人乳腺癌细胞系（MDA-MB-468）开展体外内吞实验，并在活细胞颗粒和固定细胞中分别应用拉曼光谱成像和TEM以关联原位降解对光学信号输出的实质性影响。

**IR染料筛选与AuNStar-SiO₂合成**
为筛选最适合金纳米星的表面拉曼报告分子以应对硅烷化过程中的复杂乙醇环境，研究评估了七种商售菁类染料的光物理响应。结果表明染料的吸附能力与表面电荷亲和力密切相关；特别是只有带正电荷且包含环己烯连接体的IR780p染料能够在极性差异显著的水和乙醇环境中均产生可测量的SERRS响应。基于此，研究人员采用St?ber法成功在AuNStar表面包覆并掺杂了IR780p以构建纳米壳层最终制得AuNStar-SiO₂，透射电镜确认了壳层均匀形成，同时紫外光谱的LSPR特征红移进一步验证了表面折射率环境的成功改变，并在激发态下获得了极强的特征拉曼光谱。

**二氧化硅包覆AuNStar-SiO₂的尺寸分离**
为深入厘清SERRS信号在复合纳米体系中的具体起源，研究人员利用密度梯度离心技术根据流体力学粒径将初始多相悬液精细分馏成7个亚组。光谱及电镜数据充分证明，从顶层至底层各组分中纳米颗粒的聚集态（二聚体至七聚体等）含量逐渐升高。对这些组分的SERRS强度进行定量分析发现，单体为主的组分几乎没有可测信号，而富含低聚物聚集体的组分其信号强度可激增至39倍。此结果直接揭示了细胞体系中介观尺寸的颗粒间耦合在二氧化硅内部构建的纳米间隙是诱发光学 “热点”并产生显著等离激元增强SERRS响应的根本驱动力，而孤立的单体纳米星的尖端电磁场不足以激发滞留于其内部壳层的染料分子。

**AuNStar-SiO₂在生理环境中的稳定性**
为系统考察基于二氧化硅包覆的等离激元探针在不同细胞内吞阶段pH波动下的形貌演化机制及其对光学信号的反向影响作用机制体系)，研究人员将上述组分3的颗粒群分别在pH 4、6.5、7.4及9的磷酸盐缓冲液（PBS）中进行了长达25小时的连续监测。结果显示，在模拟溶酶体极度酸性的pH 4环境中，纳米壳层维持了结构稳定；但TEM揭示高曲率纳米星尖端发生明显溶解，LSPR光谱蓝移了约100 nm，这种形态向类球状演变的缺陷愈合现象是由于Cl^-离子诱导的金表面 Ostwald 熟化机制引起的。相反地，在模拟细胞培养基或体内生理pH 7.4及更碱性环境中，壳层发生严重且持续的解离脱落现象释放出裸态纳米支晶，基元间随即引发的随机不可逆团聚体显著放大了等离激元耦合效应，导致SERRS信号出现瞬态增强；但随着水合粒径剧烈膨胀沉降，此信号最终急剧衰退至基线以下。

**体外AuNStar-SiO₂的水解与成像**
在验证了外界缓冲液中pH驱动的壳层降解及光化学响应后，研究团队进一步利用人结直肠腺癌细胞系SW48构建体外内吞综合评估平台，以比较等离激元增强在肿瘤微环境样酸性（pH 6.4）和典型培养微环境（pH 7.4）的差异。与离心管中游离环境截然不同的是，在不含血清的细胞体系中，pH 7.4培养条件虽能在摄取前诱发充分的胞外解体脱落暴露游离内核，削弱信号转导；然而共聚焦拉曼图谱统计显示，SW48细胞内分布的可测像素数量显著低于pH 6.4组（降低幅度近3倍）。为探究此现象的普适性，研究同样在乳腺癌MDA-MB-468细胞及添加血清的体系中横向复测，仍观察到完全一致的演化规律。超微电镜切片分析揭示了与摄取前后相协同的原位效应转化：pH 6.4组细胞内的降解基本被完全阻滞，颗粒形态完整均匀；但pH 7.4组由于在摄取初始即在胞外启动并历经吸收及内化阶段的快速破裂，捕获至胞内体后的亚组显示出差异显著的残核及坍缩态晶核。这种变化的“细胞内抑制效应”揭示了一个重要机理，不同于在悬液中自由水解暴露出来的部分可以自发位移进入“热点”聚集微腔；在真实受限的胞吞囊泡微米空间内，持续水解消解排出的游离内核迅速黏附蛋白等结合物阻塞了有效染料分子的优势靶向位点，进而隔断了近场等离激元间电荷转移网络。

讨论部分系统剖析了上述研究结论及其深层学术意义。研究人员明确指出，在大多数现存基于AuNStar-SiO₂传感或载药平台的系统应用评价中，多分散密度梯度造成的多晶不均一性使单体及超大重聚体光谱暗淡无光，往往会成为阻碍荧光信号稳态输出的严重技术瓶颈，而目标导向的离心筛纯可以作为提升拉曼纳米标签批次稳定性和体外细胞或体内组织标志物靶向tropism（亲和性）效率的规范化预处理手段。而二氧化硅壳层水解在活体真实生理轨迹环境中主导的光谱和物化变数关系更值得重新审视：研究深入证实尽管在中近酸性（pH 6.4）环境下残余的完整硅壳能够保护探针不滞后解构流失并输出稳健增强信号，一旦进入正常血液及细胞营养介质的微碱性环境循环，SiO₂非对称溶蚀即刻触发释放将引起SERRS强度的瞬间爆发或严重抑制。在受限细胞器中，由于水解前竞争大体积蛋白质的结合以及内吞小泡在空间位阻上抑制染料向热点的扩散和颗粒间的耦合，使得体外水解不仅未能重现悬浊体系中的信号放大，反而严重压抑了测试有效度。这些重要数据警示，针对硅烷键合修饰靶向分子的Nano-Bio界面，必须慎估并审视原位水解脱落对抗体或适配体实际靶向介导效率的次生冲击。

综上所述，该研究透彻地解析了AuNStar-SiO₂悬液及进入细胞生理环境后SERRS增强的精确动力学起源。研究结论凸显了二氧化硅包覆等离激元单层包裹在应对胞外近中性微环境时所表现出的重要但易被忽视的脆弱水解倾向性，局部微环境差异控制的降解轨迹直接演变成为细胞体内对照差异波动的主要受控诱因。此外，利用壳层基质在进入偏碱环境触发不受控快速解构的单向放大的位点敏感性，亦能为有效的体内靶向靶向智能非线性响应打开设计新径；同时借助尺寸裁剪至原裸AuNStar残核以低于肾清除阈值的特性作为触发可控消解机制设计下一代生物相容性更佳的高灵敏拉曼探针提出了极具潜力的兼容型临床应用前景，标志着分子定量成像领域向精确解析isomer聚积演化及纳米介观生物学相互作用迈出了实质性学术一步。