电化学功能化MoS2界面上DNA表面覆盖度的计时库仑法定量

《ACS Measurement Science Au》：Chronocoulometric Quantification of DNA Surface Coverage on Electrochemically Functionalized MoS2 Interfaces

　　

核酸表面覆盖度的定量控制对于开发可重复且灵敏的生物传感平台至关重要。然而，由于二硫化钼（MoS₂）基面的化学惰性，在其上建立共价定义的生物界面仍具挑战。在此，研究人员提出一种快速、环境友好的固相电接枝策略，用于功能化MoS₂表面，实现DNA构建体的快速固定和直接定量。通过电还原卤代羧酸，将羧酸根基团引入MoS₂表面，随后偶联胺端基DNA并用氨基己醇钝化，对沉积在氧化铟锡（ITO）基底上的液相剥离MoS₂纳米片进行了修饰。利用表面探针和电化学技术表征了共价连接的DNA/MoS₂界面。采用计时库仑法直接定量了匹配和错配碱基对的单链及双链构建体。单链DNA表现出朗缪尔吸附，最大表面密度Γ_max = 23 ± 3 × 10¹³ 分子·cm^–2，解离常数K_d = 1.1 nM，表明探针固定具有高亲和力和可重复性。与脂肪族类似物相比，电接枝的碘苯甲酸连接基提供了略高的探针DNA表面密度（26 ± 6 × 10¹³ 分子·cm^–2）。相反，双链构建体（包括匹配和错配序列）由于更大的空间足迹，及在某些情况下因结构扭曲，其表面覆盖度不到探针DNA的一半。总体而言，结构刚性的电接枝连接基显示出更好的探针覆盖度，可被视为在MoS₂表面设计生物传感器的可靠工具。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

过渡金属二硫族化物（TMDs）因其固有的半导体特性和可观带隙，在能源存储、柔性电子和半导体应用领域备受关注。二硫化钼（MoS₂）是该家族中用于核酸生物传感研究最广泛的成员，但主要依赖于基于吸附的检测方法。由于MoS₂纳米片的基面长期以来被认为化学惰性且难以功能化，因此在其表面建立共价定义的生物界面进展缓慢。尽管已有研究报道了通过液相化学功能化实现DNA在MoS₂上的直接共价固定，但这些方法复杂且需使用有机溶剂。此外，现有电接枝方法通常需要高电压、长时间或苛刻的反应条件（如有机溶剂、低温、避光），限制了其可扩展性和通用性。因此，开发一种环境友好、条件温和的电接枝方法对于构建生物传感界面至关重要。

**研究目的与意义**

为解决上述问题，研究人员开展了一项研究，旨在通过快速、环境友好的固相电接枝策略，在液相剥离的MoS₂表面建立共价定义的DNA/MoS₂界面，并利用计时库仑法直接定量DNA表面覆盖度及吸附等温线。该研究为在MoS₂上设计共价定义的核酸生物传感界面提供了重要见解，并直接解决了生物传感器可重复性和性能中的核心挑战——探针密度和界面异质性的变异性。论文发表在《ACS Measurement Science Au》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用的关键技术方法包括：1) 通过液相剥离法从块体MoS₂制备纳米片，并沉积在氧化铟锡（ITO）基底上；2) 在室温、水相介质中，利用计时安培法在低电位（?1.4 V）下进行60秒的固相电接枝，将卤代羧酸（如碘乙酸）共价连接到MoS₂表面，引入羧基官能团；3) 通过EDC/NHS化学活化羧基，偶联胺基修饰的DNA探针，并用氨基己醇（AH）钝化剩余活性位点；4) 利用扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDX）、原子力显微镜（AFM）、静电力显微镜（EFM）和X射线光电子能谱（XPS）表征界面形貌和化学组成；5) 采用循环伏安法（CV）和计时库仑法（CC）评估电化学性质，并以RuHex（六氨合钌）为氧化还原探针，通过Anson方程计算DNA表面覆盖度。

**研究结果**

**电接枝与界面表征：** 通过线性扫描伏安法（LSV）确定碘乙酸在MoS₂上的电还原峰电位约为?1.07 V，在?1.4 V进行60秒计时安培电接枝，电流瞬态显示明显的还原电流，证实了羧甲基自由基的生成和接枝。SEM显示原始MoS₂呈片状结构，电接枝后表面略粗糙，DNA固定后出现细小颗粒特征。AFM显示电接枝后表面粗糙度降低，DNA固定后粗糙度增加，峰谷高度差增大，证实了DNA的成功固定。EDX分析显示，原始MoS₂主要含Mo和S，电接枝后出现C和O，DNA固定后新增N和P信号，逐步验证了表面修饰。XPS分析表明，O 1s和C 1s谱中羧基相关峰增强，Mo 3d谱保留MoS₂骨架特征，证实了羧甲基基团的共价功能化。EFM显示电接枝后表面电位均匀性提高，DNA固定后由于带负电的磷酸骨架导致局部电荷积累，电位对比度增大。

**电化学行为：** CV显示，在[Ru(NH₃)₆]³⁺探针中，原始MoS₂和电接枝MoS₂（E-MoS₂）均表现出准可逆电子转移，E-MoS₂的峰分离略有增大，归因于表面修饰引入的轻微电荷传输阻碍。100次连续CV扫描表明E-MoS₂具有稳定的电化学响应。DNA固定后，经AH填充的pDNA（探针DNA）比未填充的sDNA（单链DNA）表现出更低的阳极峰电流和更对称的氧化还原曲线，表明AH改善了界面组织。

**DNA表面覆盖度与吸附等温线：** 通过计时库仑法比较不同界面的%ΔQ（RuHex与缓冲液电荷差百分比）。原始MoS₂显示出较大的正%ΔQ（120%），归因于RuHex的静电吸附；E-MoS₂则显示负%ΔQ（?33%），因高密度羧基增强了双电层电容；AH修饰进一步降低负%ΔQ至?24%，证实了钝化作用。sDNA固定后%ΔQ上升至30%，pDNA为15%，表明AH减少了非特异性吸附。不同DNA构型在100 nM浓度下，%ΔQ顺序为：pDNA (33%) > smDNA (30%) > mmDNA (17%) > dsDNA (11%)，反映了结构对磷酸基团可及性的影响。浓度依赖性实验显示，所有DNA构型的%ΔQ随浓度增加而增加并趋于平台。表面密度计算表明，pDNA的最大表面密度Γ_max = 23 ± 3 × 10¹³ 分子·cm^–2，高于文献报道的金表面硫醇DNA自组装单层。dsDNA、mmDNA和smDNA的Γ_max分别为9.8 ± 3、6.6 ± 3和10 ± 2 × 10¹³ 分子·cm^–2，归因于更大的空间足迹和结构刚性/扭曲。吸附等温线拟合表明，pDNA和mmDNA符合朗缪尔模型（K_d = 1.1 nM），而dsDNA和smDNA符合弗罗因德利希线性吸附模型，反映了表面异质性。

**连接基化学的影响：** 比较不同卤代羧酸电接枝的MoS₂表面，4-碘苯甲酸（芳香族）连接基的pDNA最大表面密度为26 ± 6 × 10¹³ 分子·cm^–2，高于4-碘丁酸（脂肪族）的14 ± 6 × 10¹³ 分子·cm^–2，表明刚性芳香族连接基更有利于高密度探针组装。

**总结与结论**

研究人员通过讨论指出，电接枝策略成功建立了共价定义的DNA-MoS₂界面，其电化学行为稳定，表面化学可控。计时库仑法能够直接测定DNA表面覆盖度，单链DNA表现出朗缪尔吸附行为，具有高表面密度和纳摩尔亲和力，而双链和错配构建体因空间和结构约束而显示较低的覆盖度和非理想吸附。链接剂化学的调控表明，芳香族碘苯甲酸连接基比脂肪族类似物提供更高的探针密度。氨基己醇填充层不会显著干扰电荷转移特性，表明形成了电子连贯的紧密薄膜。从测量科学角度，该工作直接解决了探针密度和界面异质性的变异性——这是标记电化学生物传感中误差的主要来源。结论部分翻译如下：研究人员报道了一种快速、水相、固相电接枝路线，可产生共价定义的DNA-MoS₂界面，具有可重复的电化学行为和良好控制的表面化学。通过电还原卤代羧酸在MoS₂上生成稳定的羧酸酯层，使核酸能够通过酰胺偶联高效固定，并形成致密的探针膜，这已通过表面探针和电化学表征得到证实。计时库仑法能够直接测定DNA表面覆盖度和吸附等温线，揭示单链DNA呈现朗缪尔行为，具有高表面密度Γ_max = 23 ± 3 × 10¹³ 分子·cm^–2和纳摩尔亲和力K_d = 1.1 nM，而双链和错配构建体则显示较低的堆积密度和非理想吸附，符合空间和结构约束。链接剂化学的系统变化表明可调节的探针密度，芳香族碘苯甲酸连接基比脂肪族类似物提供更高的表面负载Γ_max = 26 ± 6 × 10¹³ 分子·cm^–2。重要的是，氨基己醇回填层不会显著干扰电荷转移特性，表明形成了电子连贯的紧密薄膜。从测量科学角度，该工作直接解决了探针密度和界面异质性的变异性——标记电化学生物传感中误差的主要来源。总体而言，该工作为控制并测量MoS₂表面的核酸覆盖度提供了定量框架，直接解决了生物传感器可重复性和性能中的核心挑战。通过建立稳定、高密度且化学可调的DNA-MoS₂界面，该平台将推动标记和标记生物传感的进一步探索。这些进展使电接枝MoS₂成为多功能且可扩展的换能器平台，并为在二维过渡金属二硫族化物上合理设计电化学生物传感器奠定了基础。