自扩增RNA的肺部递送：平衡炎症与持久的转基因表达

《ACS Nano》：Pulmonary Delivery of Self-Amplifying RNA: Balancing Inflammation and Durable Transgene Expression

　　

自扩增mRNA（saRNA）正成为疫苗接种和基因治疗的主导平台。然而，saRNA及其递送所用的脂质纳米颗粒（LNPs）会激活先天免疫系统，这可能导致saRNA-LNPs的肺部递送复杂化。在本研究中，研究人员证明了气管内给予saRNA-LNPs会引起显著的副作用，这些副作用与肺部先天免疫细胞募集和细胞因子释放相关。然而，通过对LNP配方和saRNA剂量的系统优化，研究人员能够将肺部炎症限制在可接受水平。使用这些优化的saRNA-LNPs，在小鼠肺部实现了高水平的转基因表达，持续至少21天。此外，气管内递送编码SARS-CoV-2纳米抗体的优化saRNA-LNPs，在肺部产生了可检测的纳米抗体水平。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
RNA疗法，特别是自扩增mRNA（saRNA），在疫苗和基因治疗领域展现出巨大潜力。saRNA因其源自甲病毒的非结构蛋白（nsP1-4）形成的RNA依赖性聚合酶，能够在细胞内自我复制，从而在低剂量下实现持久蛋白表达，优于传统非复制型mRNA。然而，saRNA及其递送载体脂质纳米颗粒（LNPs）会激活先天免疫系统，引发炎症反应。肺部作为气体交换的主要场所，拥有复杂的免疫环境，包括大量驻留抗原提呈细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）及多种细胞因子。当saRNA-LNPs经呼吸道递送时，可能诱发严重甚至致命的肺部炎症。因此，如何平衡saRNA的转基因表达效率与炎症反应，成为肺部递送saRNA疗法面临的关键挑战。本研究旨在通过系统优化LNP配方、saRNA剂量及碱基修饰，实现肺部saRNA高效表达的同时将副作用控制在可接受水平，并探索其在SARS-CoV-2纳米抗体治疗中的应用。

**研究内容与结论**
研究人员首先比较了不同给药途径（鼻内、气管内）、N/P比（4、6、10）和saRNA剂量（2、3.5、5μg）对saRNA-LNPs在小鼠体内转染效率的影响。发现鼻内给药效率低且易溢出至肺部或全身；气管内给药后，3.5μg剂量、N/P比为6的配方在表达水平、持续时间及副作用控制方面表现最优，表达可持续至少21天。进一步评估了5-甲基胞苷（5mC）修饰和PEG-脂质比例对表达的影响，结果表明5mC修饰在呼吸道中并未增强表达，反而可能降低；1.5 mol% DMG-PEG脂质含量与0.5%或3%相比效果相当或更优。通过细胞因子分析（ELISA和RT-qPCR）和先天免疫细胞流式细胞术，研究人员发现气管内递送saRNA-LNPs会引发肺部炎症，早期（6h）以LNP载体驱动为主，后期（24h）转向saRNA驱动，其中IL-6、IL-17、IFN-β、IFN-γ、TNF-α等显著升高，且IL-6水平与体重下降和转基因表达相关。免疫荧光和流式细胞术证实，saRNA主要在肺上皮细胞和巨噬细胞中表达。最后，研究人员构建了编码SARS-CoV-2纳米抗体（分泌型Nb21和GPI锚定Nb21）的saRNA-LNPs，气管内给药后在小鼠肺组织中检测到两种纳米抗体，证明了saRNA肺部基因治疗的可行性。

**研究意义**
该研究发表于《ACS Nano》，系统优化了saRNA-LNPs的肺部递送参数，揭示了炎症反应的动态机制，为saRNA在呼吸道疾病治疗（如基因治疗、疫苗）中的安全有效应用提供了重要基础。

**主要技术方法**
研究人员使用BALB/cJRj雌性小鼠和IFN-β报告小鼠（来自德国汉诺威医学院），通过快速混合法制备saRNA-LNPs（含可电离脂质ALC-0315、DMG-PEG_2K脂质、胆固醇和DOPE，摩尔比50:1.5:38.5:10），采用微喷雾器进行气管内给药。利用体内生物发光成像、ELISA、RT-qPCR、流式细胞术、免疫荧光染色和Western blot等方法评估表达、炎症和细胞分布。

**研究结果**

**比较不同给药途径、N/P比和saRNA剂量的体内转染效率**
通过气管内微喷雾给药，比较N/P比为4、6、10及2、3.5、5μg saRNA剂量的表达。结果显示，在N/P比为6、剂量为3.5μg时，萤火虫荧光素酶表达水平最高且持续时间最长（至少21天），且副作用（呼吸急促、体重下降）最轻。N/P比为10时副作用最严重，而N/P比为4时表达较低。3.5μg/NP6组在表达成功率（所有小鼠均表达）方面最优。

**修饰核苷酸和PEG-脂质比例对saRNA-LNPs表达的影响**
与文献报道相反，5mC修饰的saRNA在气管内给药后表达低于未修饰saRNA，且IFN-β激活无显著差异。PEG-脂质摩尔比（0.5%、1.5%、3%）对表达影响不大，1.5%组表现略优。因此，选择未修饰saRNA、1.5 mol% DMG-PEG、N/P=6、剂量3.5μg为最优配方。

**气管内递送saRNA-LNPs后的呼吸道炎症反应**
6h时，空LNPs引起的细胞因子（IFN-γ、IL-17A）升高趋势强于saRNA-LNPs；24h时，saRNA-LNPs组细胞因子（IL-6、IFN-γ、TNF-α）升高更显著，尤其是IL-6与体重下降和表达水平正相关。IFN-β在24h升高后7天回归基线，显示自限性。空LNPs主要引起IL-6和IL-1β升高。

**先天免疫细胞浸润**
24h后，saRNA-LNPs和空LNPs均导致肺组织及BALF中肺募集炎症单核细胞（LRi-Mos）和炎症树突状细胞（iDCs）增加，组织驻留肺泡巨噬细胞（TR-AMs）减少（“巨噬细胞消失反应”）。saRNA-LNPs还显著上调BALF中LRi-Mos的Ly6C表达。

**肺部细胞内的递送和表达**
免疫荧光显示saRNA主要在肺上皮细胞（EpCAM⁺）和巨噬细胞（F4/80⁺）中表达。流式细胞术定量显示，仅约3%的肺细胞摄取DiD标记的saRNA-LNPs，其中约2%表达eGFP，且所有eGFP阳性细胞均为DiD阳性，但部分DiD阳性细胞未表达eGFP，尤其在巨噬细胞中。

**气管内递送编码SARS-CoV-2纳米抗体的saRNA-LNPs**
成功构建并验证了分泌型Nb21和GPI锚定Nb21的saRNA，体外显示与SARS-CoV-2刺突蛋白结合能力。气管内给药后24h，Western blot在肺组织匀浆中检测到两种纳米抗体，但BALF中未检测到，推测分泌型Nb21可能与BALF中免疫细胞结合。

**总结与讨论**
本研究系统优化了肺部递送saRNA-LNPs的配方和剂量，实现了持续21天的蛋白表达，同时将炎症反应控制在可接受范围。研究揭示了炎症反应的时序特征：早期由LNP载体驱动，后期由saRNA复制产生的dsRNA驱动。空LNPs本身即可诱发炎症，这与近期文献报道一致。saRNA在肺上皮细胞和巨噬细胞中表达，上皮细胞适合长期蛋白表达，而巨噬细胞可能利于疫苗诱导的免疫反应。气管内递送saRNA疫苗有望诱导黏膜免疫，但当前表达效率仍低于肌内注射。未来需开发更低炎症的LNP或利用修饰核苷酸/病毒蛋白降低先天免疫。

**结论翻译**
研究人员得出结论：通过系统优化脂质配方、剂量和递送途径，同时表征体内细胞转染图谱及相关炎症反应，为未来基于saRNA的呼吸道疗法提供了基础。