通过棕榈酸甲酯纳米颗粒调节血管张力增强肿瘤灌注和纳米药物递送

《ACS Nano》：Enhancing Tumor Perfusion and Nanomedicine Delivery by Modulating Vascular Tone with Methyl Palmitate Nanoparticles

　　

尽管取得了一些临床成功，但癌症纳米药物的疗效仍受到单核吞噬系统（mononuclear phagocytic system, MPS）快速清除和异常肿瘤血管床低通透性的限制。研究人员先前发现，棕榈酸甲酯纳米颗粒（methyl palmitate nanoparticles, MPN）能够安全、可逆地抑制免疫细胞吞噬活性数小时，从而改善全身给药纳米药物的肿瘤累积和疗效。在此，研究人员证明，在更短的时间尺度上，MPN可诱导血管舒张，提供了一种额外机制以增强治疗药物在恶性组织中的蓄积。MPN被巨噬细胞和内皮细胞内化后，可能以浓度和时间依赖性方式触发内源性一氧化氮（nitric oxide, NO）的释放，NO是血管舒张的关键介质。MPN给药后，光栅扫描光声介观显微镜（raster-scanning optoacoustic mesoscopy, RSOM）揭示了多个组织中的血管舒张，其中在肿瘤中观察到强烈效应。为评估增强的肿瘤蓄积，研究人员注射了70 kDa荧光葡聚糖，并通过组织学证实，24小时后，与对照组相比，仅MPN处理的肿瘤中荧光信号显著增强。此外，⁸⁹Zr标记的Feraheme（FH）纳米颗粒的正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET）成像显示，MPN预处理15分钟后，肿瘤蓄积显著增加。最后，对健康小鼠进行的一般血清生化指标和主要器官组织学分析表明，在测试条件下（单次或重复MPN给药），MPN未诱导可观察到的短期毒性。总体而言，本研究表明，MPN诱导的几分钟内发生的血管舒张增强了肿瘤内大分子和小纳米颗粒的沉积。结合其长期抑制吞噬作用的效果，这些发现表明，MPN可通过互补的、时间依赖性的机制改善治疗递送，这些机制增加了肿瘤灌注和血管通透性。

**论文解读：通过棕榈酸甲酯纳米颗粒调节血管张力增强肿瘤灌注和纳米药物递送**

**研究背景与问题**

癌症纳米药物（nanomedicines）在临床应用中面临两大核心障碍：一是系统层面，单核吞噬系统（mononuclear phagocytic system, MPS）中的库普弗细胞（Kupffer cells）、脾脏巨噬细胞、肺泡巨噬细胞及循环单核细胞等快速清除纳米颗粒，缩短其循环时间；二是组织层面，肿瘤血管结构异常、血流灌注差、内皮窗孔不规则，导致药物从血管向肿瘤实质的转运受限。此外，肿瘤细胞快速增殖导致血管床发育不全，间质液压力升高使部分血管塌陷，进一步加剧血管阻力，共同造成肿瘤内灌注高度异质性，限制小分子、大分子及纳米颗粒的递送。

已有策略包括抗血管生成治疗使血管正常化，但可能缩小内皮窗孔，不利于纳米药物蓄积；免疫调节策略通过细胞因子信号间接影响血管，但需数天才能生效。基于一氧化氮（nitric oxide, NO）的血管舒张疗法虽能快速改善血流，但NO供体存在生物相容性差、释放动力学不理想等问题。因此，亟需一种安全、快速且可调控的血管调节策略。

**研究内容与结论**

研究人员此前发现，棕榈酸甲酯纳米颗粒（methyl palmitate nanoparticles, MPN）可安全、可逆地抑制免疫细胞吞噬活性，延长纳米药物循环时间。本研究进一步揭示MPN的另一种特性：通过刺激内源性NO释放，在数分钟内诱导血管舒张（vasodilation），从而增强肿瘤灌注和纳米药物递送。MPN由天然成分白蛋白（albumin）和棕榈酸甲酯（methyl palmitate）构成，通过纳米沉淀法制备。体外实验表明，MPN被巨噬细胞和内皮细胞内化后，以浓度和时间依赖性方式促进NO释放。体内光栅扫描光声介观显微镜（raster-scanning optoacoustic mesoscopy, RSOM）成像显示，MPN注射后约16分钟，肿瘤血管宽度显著增加（平均增加约10.98 μm），而健康皮肤血管仅增加约2.83 μm。利用70 kDa荧光葡聚糖和⁸⁹Zr标记的Feraheme（FH）纳米颗粒（粒径17–31 nm）进行递送实验，发现MPN预处理15–20分钟后，肿瘤内大分子和纳米颗粒的蓄积显著增加（荧光葡聚糖阳性面积增加约1.5倍；FH的PET信号在6小时增加约100%，24小时蓄积增加约30%）。毒性评估显示，单次高剂量（3.75 mg/20 g体重）或重复低剂量（0.94 mg/20 g体重，每周两次，持续两周）MPN给药后，健康小鼠的血清生化指标、血液学参数及主要器官组织学均未观察到明显异常。该研究发表于《ACS Nano》。

**主要技术方法**

1. **MPN制备与表征**：采用纳米沉淀法（nanoprecipitation），将棕榈酸甲酯的乙醇溶液与白蛋白溶液混合超声，经纯化后获得粒径约185 nm、多分散指数0.01、Zeta电位-31.5 mV的MPN。通过动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）进行表征。
2. **细胞实验**：使用骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDM）、RAW264.7细胞和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）进行MPN摄取（共聚焦显微镜和TEM）及NO释放（Griess法）检测。
3. **体内血管成像**：在CT26结肠癌荷瘤裸鼠和健康裸鼠中，利用光栅扫描光声介观显微镜（RSOM）实时监测MPN注射后血管宽度变化，通过ImageJ和Python脚本量化ΔΔX（T4与T1时间点血管宽度变化）。
4. **纳米药物递送评估**：使用70 kDa荧光葡聚糖进行组织学荧光定量分析；采用无螯合剂⁸⁹Zr标记Feraheme（FH）纳米颗粒，通过PET/CT成像和γ计数分析24小时内的生物分布。
5. **毒性评估**：在健康C57BL/6小鼠中进行单次和重复MPN给药后的血清生化、血液学及主要器官（肝、脾、肺、肾、心）H&E染色组织学分析。样本队列来源：Memorial Sloan Kettering癌症中心动物伦理委员会批准的实验。

**研究结果**

**1. 棕榈酸甲酯纳米颗粒的理化表征与细胞摄取**
MPN呈球形，粒径约185 nm，表面带负电。共聚焦显微镜和TEM证实，BMDM、RAW264.7细胞和HUVEC均可有效内化MPN，颗粒主要分布于核周区域，且保持完整形态。

**2. 免疫细胞和血管细胞暴露于MPN后的一氧化氮释放**
Griess法检测显示，MPN处理BMDM和HUVEC后，亚硝酸盐水平在10分钟内达到峰值，并持续稳定至1小时，随后在BMDM中逐渐下降，而在HUVEC中保持近恒定至8小时。NO释放呈浓度依赖性，且伴随细胞内钙离子浓度变化。

**3. MPN诱导的健康和肿瘤组织血管舒张分析**
RSOM成像显示，MPN注射后约16分钟（T4）血管舒张达到最大。在健康小鼠中，MPN组血管宽度平均增加2.83 μm，而PBS组减少2.75 μm。在CT26荷瘤小鼠中，MPN组肿瘤血管宽度平均增加10.98 μm，显著高于PBS组的0.44 μm。MPN组在T4时间点还观察到新血管显现，提示血管可检测性提高。

**4. MPN诱导的血管舒张增强大分子肿瘤内沉积**
CT26荷瘤小鼠经MPN预处理15–20分钟后注射70 kDa荧光葡聚糖，24小时后组织学分析显示，MPN组肿瘤切片中葡聚糖阳性面积分数约为PBS组的1.5倍，且荧光信号更多分布于肿瘤中心区域，而PBS组主要分布在周边。

**5. MPN诱导的血管舒张增强纳米颗粒肿瘤内沉积**
使用⁸⁹Zr-FH（粒径17–31 nm）进行PET/CT和γ计数分析。MPN预处理后6小时，肿瘤PET信号强度约为PBS组的2倍；24小时肿瘤蓄积（%ID/g）增加约30%。肝、脾等MPS器官的FH蓄积未见显著变化，表明MPN主要通过血管舒张而非MPS抑制发挥作用。

**6. MPN处理的健康小鼠毒性测试**
单次高剂量MPN（3.75 mg/20 g）给药后，除尿酸显著降低（与NO产生相关，非毒性指标）外，其余血清生化、血液学参数及主要器官H&E染色均无异常。重复低剂量（0.94 mg/20 g，每周两次，共两周）给药后，仅乳酸脱氢酶（LDH）轻度升高，但无临床毒性意义，组织学亦未见异常。

**总结与讨论**

本研究证明了MPN作为血管调节剂的独特作用：通过刺激内源性NO释放，在数分钟内诱导肿瘤血管舒张，显著增强大分子和纳米颗粒的肿瘤内沉积。与先前发现的4小时吞噬抑制机制互补，MPN可通过调整预处理时间（15分钟 vs. 4小时）分别优化小纳米颗粒（<30 nm）和大纳米颗粒（>100 nm）的递送。研究结论指出，MPN给药诱导的快速系统性血管舒张在CT26肿瘤血管中比健康皮肤血管更显著，机制上可能由巨噬细胞和内皮细胞释放NO介导，从而增强血管灌注和通透性。毒性分析表明，单次和重复MPN给药在健康小鼠中耐受性良好。这些发现表明，MPN预处理的时间窗口可策略性地用于优化不同尺寸治疗药物的肿瘤递送，且两种机制（血管舒张与吞噬抑制）可结合使用，为灵活改进纳米药物递送提供了新策略。