《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Perspectives of Bacterial PAPS-Independent Aryl Sulfotransferases for Practical In Vitro Sulfation
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PAPS非依赖性细菌芳基磺基转移酶（ASTs）不像哺乳动物磺基转移酶那样需要昂贵且不稳定的辅因子PAPS。相反，研究人员使用简单的芳香硫酰供体。最初在肠道细菌中发现，ASTs表现出显著的底物多样性，催化酚类、醇类、胺类、糖类和多酚类（包括黄酮类和黄酮木脂素类）
PAPS非依赖性细菌芳基磺基转移酶（ASTs）不像哺乳动物磺基转移酶那样需要昂贵且不稳定的辅因子PAPS。相反，研究人员使用简单的芳香硫酰供体。最初在肠道细菌中发现，ASTs表现出显著的底物多样性，催化酚类、醇类、胺类、糖类和多酚类（包括黄酮类和黄酮木脂素类）的硫酸化。其中，来自Desulfitobacterium hafniense的AST（DhAST）因其稳定性和广泛的底物范围而特别引人注目。结构和机制研究表明，ASTs遵循一种乒乓双-双机制（ping-pong bibi mechanism），并涉及瞬时酶硫酸化。最近从不同细菌物种中鉴定出的新ASTs以及重组表达方面的进展，拓宽了这些酶在体外选择性、可规模化合成硫酸化代谢物方面的潜力。扩大现有的AST文库加深了对细菌硫酸化途径的理解，并支持其在生物催化、代谢物合成以及硫酸化生物分析标准品生产中的应用。
微生物PAPS非依赖性ASTs：第一个假定的PAPS非依赖性芳基磺基转移酶（AST）在米曲霉（Aspergillus oryzae）粗提物中被发现，其通过形成酶-硫酸盐中间体，遵循乒乓反应机制，且不能利用PAPS作为硫酰供体。首个报道的细菌AST来自人类肠道微生物群中的Eubacterium A-44，表现出严格的磺基转移酶活性，且其活性可通过添加供体底物如对硝基苯基硫酸盐（pNPS）来促进。随后，许多研究中的ASTs来自哺乳动物肠道微生物群，如Haemophilus K-12、Klebsiella K-36等，其中Klebsiella K-36的astA基因首次在大肠杆菌中异源表达，成为首个重组AST。其他重组ASTs还来自Enterobacter amnigenus AR-37、Citrobacter freundii等，这些ASTs均含有两个连续开放阅读框astA和dsbA，后者编码硫醇-二硫键氧化还原酶（DsbA），引导AST进入周质。来自尿路致病性大肠杆菌CFT073的EcAST，其结构中含有一个关键的二硫键，且需要DsbL/DsbI系统才能高效产生功能性AST。来自Desulfitobacterium hafniense的DhAST是研究最深入的细菌AST之一，它能硫酸化小芳香醇、脂肪醇、糖类、类固醇和多酚类物质，且因高稳定性可在粗细胞裂解液中直接使用。基于序列同源性分析，研究人员鉴定并表达了多个新候选AST，如来自Desulfosporosinus sp. HMP52的DsAST、Desulfofalx alkaliphila的DalAST等。此外，生物信息学分析在人类肠道微生物Sutterella属中发现了潜在AST，并在Bacteroides vulgatus中鉴定出新型AST（BvAST），其具有广泛的底物特异性。
结构与功能：哺乳动物磺基转移酶（SULTs）遵循顺序双-双机制，需要辅因子PAPS参与。而细菌ASTs遵循乒乓双-双催化机制，通过形成酶-供体中间复合物进行反应。早期研究利用标记的硫酰供体(35S)-对硝基苯基硫酸盐分离出中间体，并鉴定出硫酸化氨基酸为酪氨酸。随后，对Enterobacter amnigenus AST的定点诱变表明，第123位酪氨酸是关键活性位点氨基酸。目前，EcAST是唯一具有解析晶体结构的AST，其晶体结构（PDB: 3ELQ）显示为同源二聚体，每个单体包含N端7链β-三明治结构域和C端6叶β-螺旋桨结构域。进一步分析表明，EcAST通过乒乓机制催化硫酰基转移，涉及His436的瞬时硫酸化，这是一种此前未知的蛋白质共价修饰。而以前研究提出的酪氨酸残基（如Tyr96）在EcAST中远离活性位点，不参与催化。活性位点由碱性氨基酸His252、His356、Asn358、Arg374和Thr501组成，它们可能协调硫酰基团并解释催化所需的碱性pH。对多种AST的序列比对揭示了两个不同簇：簇I主要来自变形菌门，簇II来自厚壁菌门。DhAST和EcAST分别属于不同簇。催化组氨酸残基（EcAST的His436）及其相邻残基在所有已知AST中高度保守，而之前提出的Tyr96仅在簇I中保守（除BvAST外）。
AST的底物：ASTs对硫酰供体和受体均具有特异性。最常用的供体是对硝基苯基硫酸盐（pNPS）和4-甲基伞形酮硫酸盐（MUS），后者荧光检测灵敏度更高，前者更常用于常规活性测定和制备性硫酸化。其他供体包括对硝基儿茶酚硫酸盐、对乙酰基苯基硫酸盐、吲哚酚硫酸盐、苯基硫酸盐、α-或β-萘基硫酸盐等。新型供体N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐和N-邻苯二甲酰亚胺硫酸盐也被提出，但前者对产物分布影响有限，后者未检测到活性。近期研究还测试了生物相关硫酸化化合物如对乙酰氨基酚硫酸盐、多巴胺硫酸盐等作为供体。尽管多种供体被测试，pNPS因其易得、显色、可检测且不易被重硫酸化，仍是首选。所有报道的ASTs均不能利用PAPS作为供体，但来自Haliangium ochraceum的HocST显示出独特的PAPS依赖性芳基磺基转移酶活性，并可能具有类似AST的活性。
硫酰受体方面，早期研究集中于小酚类化合物如苯酚、儿茶酚、酪胺、对羟基苯甲酸酯类及含酪氨酸肽段。DhAST的突破性进展在于能硫酸化脂肪醇如丁醇、2-苯乙醇、甘油等，以及类固醇如雌酮和雌二醇，制备反应中17β-雌二醇-3-O-硫酸盐产率达80%。对糖类底物的硫酸化，通过将糖基连接芳香基团（如苯酚或pNP）可提高转化率，但直接硫酸化糖类效率较低。通过定向进化获得的DhAST突变体ASTB-V1（Val579Asp）对葡萄糖的活性提高了5.4倍。此外，来自Hungatella effluvii的HefAST对N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的活性比DhAST高约6倍，是合成硫酸化糖和寡糖的有前景工具。多酚类受体是另一重要类别，如来自水飞蓟的黄酮木脂素（水飞蓟宾、异水飞蓟宾等），DhAST可实现高效区域选择性硫酸化，产物光学纯度好。相比之下，哺乳动物AstIV只能硫酸化水飞蓟宾B，且产率低。在黄酮类化合物中，优先硫酸化位点为C-3′和C-4′羟基，随后是C-7，可形成二硫酸酯。间苯三酚等多数酚酸因羧基降低反应pH而难以硫酸化，但对香豆酸因共轭双键而可作为合适受体。胺类化合物如苯胺和环己胺也可被某些ASTs硫酸化，表明ASTs能硫酸化氨基。一些底物如白杨素因缺乏B环羟基而硫酸化效率低，但新型ASTs如DalAST和CfAST可提高其转化率至9%。总体而言，ASTs的受体范围已大幅扩展，未来研究可关注更大更复杂的受体如抗生素及糖胺聚糖（GAGs）等。解析关键AST（如DhAST和DalAST）的晶体结构将为理性酶工程和底物改造铺平道路。
