强调真实参考化学品在常规样品分析中未知物明确鉴定中的重要性——一个OPCW能力验证案例

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Highlighting the Importance of Authentic Reference Chemicals in the Unambiguous Identification of Unknowns during Routine Sample Analysis─An OPCW Proficiency Test Case

　　

在常规样品分析中，未知化学品的明确鉴定是分析化学领域中的常见任务。该过程可能极其繁琐，尤其在初步鉴定的未知物可能具有产生相同精确质量数和非常相似质谱图（mass spectra）的同分异构体时。在本研究中，研究人员介绍了在第五十四届禁止化学武器组织（OPCW）能力验证（proficiency test）中，从硅胶基质中正确鉴定1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物（1,4-oxathiane 4,4-dioxide）并区分其结构异构体2-羟乙基乙烯基砜（2-hydroxyethyl vinyl sulfone）的实验过程。在发现初步气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析中2-羟乙基乙烯基砜的库生成质谱图与真实参考化学品（authentic reference chemical）的质谱图不匹配后，研究人员启动了一项未知结构确定工作，涉及气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）和核磁共振（NMR）波谱学。所有获得的信息，结合真实参考化学品的合成，被用于确定未知物为1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物。本文描述的过程强调了真实参考化学品在常规样品分析中鉴定未知化学品时的重要作用。

**论文解读：真实参考化学品在未知物鉴定中的关键作用——以OPCW能力验证为例**

**研究背景与问题**

1997年生效的《化学武器公约》（CWC）旨在全球范围内根除化学战剂（CWAs），并委托禁止化学武器组织（OPCW）负责监控和管制可用作CWAs前体的化学品。这些化学品按与CWAs的关联程度被分为附表1至附表3，其中附表1包含实际CWAs，附表2和附表3涵盖其他有毒化学品及前体。检测环境样品中的附表化学品或其降解产物，可能表明某地存在CWAs的生产或使用。然而，CWC并未列出所有相关化学品，而是分类描述（如“O-烷基（≤C10，含环烷基）烷基（Me, Et, n-Pr或i-Pr）膦酰氟化物”），导致可能涉及数百种化合物。此外，CWC随新CWAs及其生产化学品的出现而不断扩展，且相关化学品物理性质差异大，单一分析技术难以覆盖所有检测需求。因此，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）基于电子电离（EI）的标准化方法常作为首选工具，但极性化学品（如CWAs降解产物或合成原料）往往需要衍生化处理后方可检测，或需借助液相色谱-质谱（LC-MS）。然而，LC-MS对部分极性化学品（如频哪醇、环状砜和亚砜）的电离效率有限，故实验室需具备多种分析手段及衍生化策略。

OPCW指定实验室网络是该组织核查制度及调查CWAs使用指控能力的关键组成部分。为维持指定实验室资格，全球成员实验室每年需参加OPCW能力验证（PT）测试。每次PT中，样品制备实验室将若干报告化学品以1–50 ppm浓度掺入固体和/或液体基质，并添加干扰物（如柴油、聚乙二醇）以增加鉴定难度。成功完成测试要求使用两种或以上分析技术准确检测、鉴定并确认报告化学品；若鉴定错误，实验室将丧失指定资格。多数指定实验室采用类似策略：先用GC-MS（EI）结合质谱数据库（如NIST、AMDIS）进行初步筛选，通过库匹配获得候选化合物；若匹配度不足，则提供有限候选物供合成比较。然而，明确鉴定必须使用真实参考化学品（authentic reference chemical）在相同条件下进行分析，以证明其保留时间和质谱图与样品中未知物一致。鉴于CWC相关化学品报告可能带来的严重后果，鉴定过程必须准确无误。

**研究开展及结论**

本研究以研究人员所在实验室参与第54届OPCW环境PT测试时遇到的一个案例为例，说明真实参考化学品在未知物明确鉴定中的关键作用。初步GC-MS分析显示，固体样品S1（硅胶基质）中存在一保留时间14.3分钟的化合物，经NIST库匹配初步鉴定为2-羟乙基乙烯基砜（CAS号4271–48–1），匹配度高达947（85%概率）。研究人员按常规合成了该化合物，但在GC-MS分析中发现其保留时间和质谱图均与样品中未知物不符；合成化合物的最佳NIST库匹配竟为双(2-羟乙基)砜（匹配度697，64.8%概率）。这一矛盾促使研究人员重新评估数据，并采用更多分析技术进行后续工作。通过气相色谱-质谱联用化学电离（GC-MS (CI)）和气相色谱-串联质谱联用化学电离（GC-MS-MS (CI)）分析，发现未知物的分子离子为[M+H]⁺ = 137，分子量136；高分辨率Orbitrap液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）进一步确认[M+H]⁺精确质量为137.0267，对应化学式C₄H₉SO₃（计算值137.0268）。这些数据表明，该化合物可能是2-羟乙基乙烯基砜的结构异构体——1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物（CAS号107–61–9）。该化合物虽非附表化学品，但作为芥子气（bis(2-chloroethyl)sulfide）的降解产物，属于OPCW指南中的报告化合物。研究人员通过氧化1,4-氧硫杂环己烷合成了1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物，经纯化后进行GC-MS分析，确认其质谱图与样品未知物完全匹配。此外，LC-MS-MS分析显示未知物与合成参考化学品的保留时间和MS-MS谱图一致；质子核磁共振（¹H NMR）谱图也证实样品中不存在2-羟乙基乙烯基砜的乙烯基质子（化学位移5.0–7.0 ppm），而1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物的亚甲基质子信号（δ 3.13和4.15 ppm）与样品匹配。另一关键观察是，早期分析中未知物不与N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）发生衍生化反应，这进一步质疑了原始库匹配，因为2-羟乙基乙烯基砜的羟基应能被硅烷化。综合所有数据，研究人员最终确定未知报告化合物为1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物，并在最终报告中正确报告，实验室因此保留了OPCW指定实验室资格。该案例表明，仅依赖单一分析技术的库匹配不足以鉴定化合物（且本案例发现某质谱库条目存在错误），必须结合多种正交技术（如LC-MS-MS、NMR）并与真实参考化学品进行比对，才能实现明确鉴定。

**主要关键技术与方法**

研究人员采用的关键技术方法包括：气相色谱-质谱联用电子电离（GC-MS (EI)）进行初步筛选和库匹配；气相色谱-质谱联用化学电离（GC-MS (CI)）及气相色谱-串联质谱联用化学电离（GC-MS-MS (CI)）确定分子离子；高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS，使用Orbitrap质谱仪）获取精确质量数及MS-MS谱图；质子核磁共振（¹H NMR）波谱学进行结构确认；以及通过合成获得真实参考化学品（1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物和2-羟乙基乙烯基砜）。样本来源为第54届OPCW环境PT测试中的模拟固体废料样品（硅胶基质）。

**研究结果**

**A Challenge Arises during an OPCW PT**
通过GC-MS (EI)初步分析样品S1，发现一保留时间14.3分钟的化合物，NIST库匹配高概率（R. Match: 947，85%概率）鉴定为2-羟乙基乙烯基砜。但合成该化合物后进行GC-MS分析，发现其保留时间和质谱图与样品未知物不符，且合成化合物的最佳库匹配为双(2-羟乙基)砜（R. Match: 697，64.8%概率），表明初始库匹配可能存在错误。

**Reference Chemicals Provide Crucial Information during Unknown Analysis**
GC-MS (CI)和GC-MS-MS (CI)分析显示未知物分子离子为[M+H]⁺ = 137，分子量136。高分辨率LC-MS-MS数据确认[M+H]⁺精确质量为137.0267，分子式C₄H₉SO₃，提示该化合物为2-羟乙基乙烯基砜的异构体1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物。合成并纯化该化合物后，GC-MS分析证实其质谱图与样品未知物匹配，而NIST库将其错误归属为2-羟乙基乙烯基砜（匹配度855，15%概率），进一步说明库匹配的局限性。

**Further Confirmation of Unknown’s Structure Is Established**
LC-MS-MS分析显示未知物与合成1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物的保留时间和MS-MS谱图一致；¹H NMR分析（H₂O抑制）未在样品中检测到2-羟乙基乙烯基砜的乙烯基质子（5.0–7.0 ppm），而1,4-氧硫杂环己烷4,4-二氧化物的亚甲基质子信号（δ 3.13和4.15 ppm）在样品中匹配。此外，未知物不与BSTFA发生衍生化反应，这与其无羟基的环状结构一致，进一步排除了2-羟乙基乙烯基砜的可能性。

**结论与讨论**

本文描述的过程表明，在OPCW能力验证中，仅基于单一分析技术的库匹配不足以明确鉴定未知化合物（本案例还发现某质谱库条目错误）。可靠地推断未知物身份需要结合多种分析技术（如LC-MS-MS和NMR）的数据，并与真实参考化学品进行全面比较，以实现明确确认。此案例强调了合成参考化学品在化学鉴定中的核心作用。这些参考化学品通常根据紧迫时间需求合成或商业购买，为分析师鉴定未知物提供了高度信心。论文发表在《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》上。