《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Formation of Advanced Glycation End Products during Frying of Potato Chips and Grilling of Beef Patties
编辑推荐：
美拉德反应发生于还原糖与赖氨酸的N6-氨基及精氨酸的胍基功能团之间，最终导致晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products, AGEs）的生成。在本研究中，研究人员对市售马铃薯片中的15种AGEs进行了全面分析，其总含量接近
美拉德反应发生于还原糖与赖氨酸的N6-氨基及精氨酸的胍基功能团之间，最终导致晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products, AGEs）的生成。在本研究中，研究人员对市售马铃薯片中的15种AGEs进行了全面分析，其总含量接近5 mg/100 g薯片，并研究了马铃薯切片油炸过程中蛋白质修饰的变化。主要的赖氨酸蛋白质修饰为N6-羧甲基赖氨酸（N6-carboxymethyl lysine, CML）、N6-羧乙基赖氨酸（N6-carboxyethyl lysine, CEL）、吡咯啉（pyrraline）及N6-甲酰基赖氨酸（N6-formyl lysine），含量在500–950 μg/100 g薯片之间。此外，研究人员合成并检测了N6-(2,3-二羟基丙基)赖氨酸（N6-(2,3-dihydroxypropyl)lysine, DPL）作为甘油醛衍生的AGEs前体探针，并首次在加工食品基质中定量了1-(5-氨基-5-羧基戊基)-3-(5-氨基-5-羧基戊基氨基)吡啶盐（meta-DLP）及2-铵基-6-(3-氧化吡啶鎓-1-基)己酸酯（OP-lysine）。随后将这些结果转移至含核糖的牛肉饼烤制研究中，通过N2-t-Boc-赖氨酸与标记的1-13C-及5-13C-核糖的孵育，深入揭示了戊糖降解相关的AGEs机理。
该研究发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》。研究背景方面，食品的热加工如烘焙、烤制和油炸会引发一系列化学反应，其中美拉德反应（Maillard reaction）最为显著，它不仅是加工食品中香气化合物的主要来源，也会导致游离氨基酸或蛋白质侧链与还原糖发生非酶褐变反应，生成结构各异且稳定的蛋白质加合物，即晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products, AGEs）。早期反应包括希夫碱（Schiff base）形成及随后的阿马多里重排产物（Amadori products），这些氨基酮糖在后期易降解产生高活性羰基物种，特别是乙二醛（glyoxal, GX）和甲基乙二醛（methylglyoxal, MGX）等1,2-二羰基化合物，进而与亲核性蛋白质侧链反应生成CML、CEL等多种AGEs。目前虽常以CML、CEL及5-羟甲基糠醛作为加工食品标志物，但考虑到美拉德反应产生的结构众多，其实际谱系应更广泛。从营养角度看，AGEs形成会导致必需氨基酸损失从而降低食品营养价值，且糖基化蛋白经胃肠道水解吸收及转运进入血液循环的机制已被部分阐明，因此加工食品中AGEs的定量及日常摄入量成为当前研究热点。然而，关于特定前体亚胺尤其是C3-亚胺的信息有限，且对于吡啶鎓类AGEs在加工食品中的具体形成信息缺乏，这构成了开展本研究的主要原因。研究人员通过开展马铃薯片商业样品分析及油炸过程的时序监测，结合牛肉饼烤制实验及同位素标记模型孵育，系统分析了15种AGEs及其他氨基酸修饰的形成规律与前体机理，得出甲基乙二醛途径在油炸马铃薯中占主导、核糖是肉类烤制中吡啶鎓AGEs的重要前体等结论，并首次在食品基质中定量了数种吡啶鎓AGEs，对完善热加工食品有害物评估及美拉德化学机理具有重要意义。
为开展研究，研究人员主要采用的关键技术方法包括：采集当地超市市售未调味马铃薯片样本（n=20）及区域超市新鲜碎牛肉样本制备肉饼；对样本进行脱脂、蛋白质提取（采用酶解淀粉及乙醇沉淀法）及酸水解或酶解（使用木瓜蛋白酶、Pronase E、亮氨酸氨基肽酶及羧肽酶Y）处理；利用高效液相色谱串联质谱（HPLC–MS/MS）在正模式电喷雾电离（ESI）下进行AGEs定量分析与高分辨质谱（HR-MS）鉴定；通过1H及13C核磁共振波谱（NMR）表征合成标准品结构；在磷酸缓冲液中于37°C及通氩除氧条件下进行N2-t-Boc-赖氨酸与羰基化合物或标记13C-核糖的模型孵育；在160°C下对马铃薯切片进行不同时间油炸及在230°C下对牛肉饼双面烤制并监测表面温度；利用荧光检测器高效液相色谱（HPLC-FLD）分析核糖含量；采用标准加入法进行定量分析并进行两样本t检验及Welch检验统计评估。
研究结果部分保留原文小标题并说明如下：
Formation of Pyridinium AGEs in Deaerated and Aerated Model Incubations with Reducing Sugars
研究人员通过在pH 7.4、37°C条件下进行有氧及脱氧模型孵育，发现乙二醇醛（glycolaldehyde, GA）专一生成2-铵基-6-[4-(羟甲基)-3-氧化吡啶鎓-1-基]己酸酯（HOP-lysine），而甘油醛（glyceraldehyde, G3）专一生成2-铵基-6-[5-(羟甲基)-3-氧化吡啶鎓-1-基]己酸酯（GLAP）。脱氧条件下GA生成HOP-lysine的量约为有氧条件下的2倍，因有氧时GA被氧化为GX从而增加CML生成；GLAP形成不受通气影响。GX或MGX孵育未生成这两种吡啶鎓AGEs，证实GA和G3分别为其唯一短链前体。糖类孵育显示GLAP仅见于核糖及有氧抗坏血酸孵育，HOP-lysine则在所有C4及C5糖中形成，C4糖如D-苏糖、D-赤藓糖及L-赤藓酮糖产量更高，表明立体化学驱动该途径。
Extraction of Potato Chips Protein and Determination of AGE Levels in Commercial Chips
研究人员从市售薯片中提取蛋白质（得率60%–70%，纯度约50%），经还原酸解及酶解后利用HPLC–MS/MS分析。酸稳定修饰中CEL为700 μg/100 g，CML为500 μg/100 g，CEL/CML比为1.4:1，提示MGX是主要前体；MOLD高于GOLD。首次定量meta-DLP为0.13 ± 0.04 μg/100 g，检出GLAP约1.5 μg/100 g及OP-lysine约6.9 μg/100 g，HOP-lysine低于定量限。酶解检出酸不稳定修饰中CEA为650 μg/100 g，MG-H（MG-H1/H3）为500 μg/100 g，pyrraline为880 μg/100 g，N6-formyl lysine高达950 μg/100 g为最主要修饰，N6-acetyl lysine为500 μg/100 g，GALA为130 μg/100 g，氧化标记物邻酪氨酸为182 μg/100 g。
Determination of AGEs during the Frying Process of Potato Chips
研究人员在160°C下对马铃薯片油炸2、5、8、11、16分钟并定时取样分析。11分钟后所有分析物显著增加，与水分流失及褐变相关。CML由原料19 mg/kg蛋白增至901 mg/kg蛋白，CEL比例相似（CML:CEL为1:1.2）。呋喃西（furosine）由65增至8750 mg/kg蛋白且无降解，源于淀粉持续降解供糖。吡啶鎓AGEs中OP-lysine由0.10升至3.75 mg/kg蛋白（11分钟），最后4分钟三者均增近4倍。还原产物HEL及DPL在11分钟内由20升至130 mg/kg蛋白后达平台，证明油炸中产生G3；HEL-1D占比由23%降至7%，显示GA氧化为GX效率高，但HOP-lysine仍低于定量限。
Determination of Advanced Glycation End Products in Meat
研究人员分析230°C烤制牛肉饼（原生及添加核糖或赤藓酮糖）的AGE变化。生肉含核糖0.41 mmol/kg，烤6分钟后CEL由9.1增至31.7 mg/kg蛋白，CML由7.3增至27.0 mg/kg；OP-lysine由22.8微增至24.2 μg/kg且无显著变化。添加10倍核糖烤制使CML、CEL翻倍，OP-lysine近三倍，并检出meta-DLP（3.2 μg/kg）及HOP-lysine（14.2 μg/kg），GLAP仍低于定量限；添加L-赤藓酮糖使HOP-lysine大幅增至60.3 μg/kg。用1-13C及5-13C核糖孵育揭示CML约67%经Amadori产物氧化裂解、31%经GX途径；CEL的4:6比率反映核糖骨架片段来源；HOP-lysine标签分布支持由C4片段与GA结合而非单纯GA三聚；OP-lysine几乎全为单标签掺入，表明其由核糖整碳骨架与赖氨酸反应形成，挑战了双Amadori中间体概念，提出第三种形成机制。
总结讨论部分，研究人员指出本报告全面分析了薯片AGE含量，甲基乙二醛相关赖氨酸及精氨酸AGEs（CEL、CEA、MG-H）总计达1850 μg/100 g，其次为pyrraline（880 μg/100 g）及CML（500 μg/100 g），意外发现N6-formyl lysine（950 μg/100 g）为单一最主要修饰。首次定量了食品基质中吡啶鎓AGEs（OP-lysine、meta-DLP、HOP-lysine），扩展了薯片及烤牛肉饼的AGE谱。通过鉴定薯片中相应赖氨酸亚胺确认了甘油醛对吡啶鎓AGEs（OP-lysine、GLAP、meta-DLP）形成的重要性；对于OP-lysine，建立了核糖整合全碳骨架生成的新机制。
研究结论部分原文翻译为：总之，本报告对马铃薯片中的AGE含量进行了全面分析。甲基乙二醛相关的赖氨酸和精氨酸AGEs（CEL、CEA、MG-H）总计高达1850 μg/100 g薯片，其次是pyrraline和CML（分别为880和500 μg/100 g）。出乎意料的是，酰胺类AGE N6-formyl lysine以950 μg/100 g的含量成为单一主要修饰物，其重要性应在未来研究中深化。研究人员首次在食品中定量了吡啶鎓AGEs OP-lysine、meta-DLP和HOP-lysine，扩展了马铃薯片和烤牛肉饼中的AGE谱。通过在马铃薯片中鉴定并关联相应的赖氨酸亚胺，证实了甘油醛对于吡啶鎓AGEs OP-lysine、GLAP和meta-DLP形成的重要性。对于OP-lysine，研究人员建立了一条源自核糖的新机理途径，该途径整合了完整的碳骨架。
