《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Data-Independent Acquisition for Improved Compound Annotation in MALDI MS Imaging
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基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）能够实现生物组织内生物分子的空间映射，而传统的基于MS1的工作流程常导致化合物注释模棱两可。数据依赖采集（DDA）可提高注释特异性，但偏向于高丰度离子且缺乏重现性。在此，研究人员提出了一种新型MALDI MSI
基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）能够实现生物组织内生物分子的空间映射，而传统的基于MS1的工作流程常导致化合物注释模棱两可。数据依赖采集（DDA）可提高注释特异性，但偏向于高丰度离子且缺乏重现性。在此，研究人员提出了一种新型MALDI MSI工作流程，整合了数据非依赖采集（DIA），以同时获取空间信息和碎片信息。在该方法中，MS1和DIA MS2谱图在样品上交替采集，无需预先了解化合物定位。每个图像像素由一个MS1和多个DIA MS2子像素组成，既为MS1数据提供了高空间分辨率，又提供了广泛的m/z覆盖范围。使用小型随机化的m/z隔离窗口可减少谱图重叠并提高碎片离子特异性。数据使用扩展的Compound Discoverer进行处理，该软件集成了mzCloud和LipidSearch用于化合物注释。将该工作流程应用于寄生蠕虫肝片吸虫（Fasciola hepatica）的组织，通过结合前体质量、DIA MS2和空间相关性信息，生成了详细的脂质图谱并提高了注释置信度。研究人员的结果表明，DIA提供了一种灵活的策略，可将碎片信息整合到MALDI MSI中，从而扩展其在空间代谢组学中的能力。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）是一种强大的分析技术，结合了高分辨率质谱与空间分辨分析，能够在细胞甚至亚细胞水平上检测和定位组织样品中的化合物，为空间代谢组学提供重要见解。然而，传统MALDI MSI工作流程主要依赖MS1全扫描数据，基于前体离子m/z值进行化合物注释，这常因多种组分具有相同或近似m/z值而导致注释模糊。数据依赖采集（DDA）可整合MS2碎片信息以提高注释特异性，但DDA倾向于选择高丰度前体离子进行碎裂，忽略了低丰度化合物，且重现性差。此外，现有的靶向MS2成像方法需要预先定义前体离子，覆盖范围有限。因此，亟需一种无偏、高重现性的方法，将碎片信息无缝整合到MALDI MSI中，以改善化合物注释的准确性和可靠性。
**研究内容与结论**
研究人员开发了一种基于数据非依赖采集（DIA）的MALDI MSI工作流程，该流程将空间分辨的MS1成像与互补的DIA MS2碎片信息相结合。通过使用随机化的小型隔离窗口（3 Da），交替采集MS1和DIA MS2谱图，实现了无偏的碎片离子覆盖，提高了空间采样鲁棒性。数据使用扩展的Thermo Scientific Compound Discoverer（CD）处理，集成mzCloud和LipidSearch进行化合物注释，并通过前体质量、DIA MS2谱图匹配和空间相关性过滤提高注释置信度。将工作流程应用于肝片吸虫（Fasciola hepatica）组织切片，成功注释了模型化合物伊马替尼（imatinib）和9个高置信度磷脂类脂质组（如PC 32:0），证明了DIA能够有效整合碎片信息，扩展MALDI MSI在空间代谢组学中的能力。该论文发表在《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》。
**关键方法（不超过250字）**
研究人员采用的关键技术方法包括：使用大气压（AP）MALDI源（TransMIT GmbH）与Orbitrap Exploris 480质谱仪联用，在正离子模式下以10 μm步长进行像素模式扫描；交替采集MS1（分辨率240,000 at m/z 200）和DIA MS2（分辨率45,000 at m/z 200，归一化碰撞能30%），其中DIA使用随机化隔离窗口列表（覆盖m/z 650–899 Da，3 Da宽度，另含伊马替尼窗口m/z 492.5–495.5）；数据通过扩展的Compound Discoverer 3.4处理，该软件集成了mzCloud（在线质谱数据库）和LipidSearch（脂质鉴定工具），并开发了自定节点以将MS1谱图与DIA MS2谱图基于空间位置和前体离子信息关联，通过高前体丰度与低共隔离干扰的谱图筛选提高注释质量。样本来源于大鼠感染模型培育的成年肝片吸虫（Fasciola hepatica），经伊马替尼处理4小时后制备20 μm厚切片。
**研究结果**
**Overview of the Data Acquisition Method**
研究人员定义了像素与子像素的概念：每个图像像素包含一个MS1谱图和多个DIA MS2子像素（如2×2阵列），子像素共享相同空间分辨率。通过随机化DIA隔离窗口在组织上的分布，避免了系统采样偏差，提高了不同m/z区域的空间采样概率。同时揭示了DIA窗口宽度、数量与空间采样密度之间的权衡：窗口越宽，谱图复杂度越高；窗口越多，空间采样间隔越大，可能遗漏局部化合物。
**Compound Discoverer Workflow**
研究人员扩展了Compound Discoverer（CD），使其适用于MSI数据。工作流程首先将每个谱图分配至空间坐标，然后基于MS1数据识别m/z范围并重建图像。LipidSearch和mzCloud以谱图为中心模式运行，不依赖色谱保留时间。针对DIA MS2谱图，研究人员开发了前体分配步骤：通过MS1前体离子分布与DIA隔离窗口信息关联，并优先选择高前体丰度、低共隔离干扰的谱图进行库匹配，从而避免全谱反卷积。此外，通过Pearson相关系数评估不同加合物形式脂质图像的空间相似性（>0.7视为支持）。
**Raw File Acquisition and Quality Assessment**
在肝片吸虫样品上，研究人员以2×2子像素结构采集了230×686个子像素，最终图像分辨率为115×343像素（20×20 μm/像素），覆盖2.3×6.8 mm2区域。DIA采集包含83个3 Da窗口（m/z 650–899）和1个伊马替尼窗口，共约158,000个谱图，采集时间约30小时。通过评估DHB簇离子和磷酸胆碱碎片离子的质量偏差，研究人员发现MS1和MS2质量精度分别稳定在±2 ppm和±4 ppm内，无漂移，因此将前体质量容差设为±3 ppm，碎片质量容差设为±5 ppm。
**DIA MS2-Based Identification of Imatinib**
以伊马替尼（[M+H]?, m/z 494.2666）为模型化合物，研究人员展示了DIA工作流程的有效性。MS1图像显示伊马替尼分布于整个组织，在肠道和卵黄腺组织中信号最高。通过叠加DIA MS2采集点，研究人员发现只有包含伊马替尼前体离子的隔离窗口窗口内的谱图才能被成功注释。经过空间筛选，选择高前体丰度、低干扰的谱图进行mzCloud库匹配，结果在多个位置成功匹配到伊马替尼碎片谱图，验证了前体关联策略的可行性。
**DIA MS2-Based Identification of Lipids**
研究人员使用LipidSearch进行脂质注释。基于前体质量仅得到550个候选脂质组，结合DIA MS2碎片信息后减少至393个，排除了约150个候选（如PE脂质因缺失141.0191 Da中性丢失碎片而被排除，PC和HexCer因缺失特征碎片离子被排除）。进一步通过空间相关性过滤（不同加合物图像Pearson相关系数>0.7）和DIA MS2谱图一致性检查，最终将393个候选减少至9个高置信度磷脂注释（如PC 32:0，以[M+H]?、[M+Na]?、[M+K]?形式检测）。此外，研究人员还发现了两个未注释的化合物（可能为HexCer 38:0;O4和HexCer 36:0;O3），但由于碎片信号弱，仅可初步推测。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，DIA结合MSI可有效整合碎片信息，减少对高丰度离子的偏向，提高低丰度化合物的检测概率，并支持回顾性分析。然而，DIA存在隔离窗口宽度与空间采样之间的权衡：宽窗口增加谱图复杂度，窄窗口降低空间采样频率，可能导致局部化合物漏检。此外，PE脂质注释缺失可能源于离子化效率低而非实际不存在，提示需谨慎解释基于MS2的注释。工作流程未进行全谱反卷积，因此无法提供所有化合物的明确结构解析，但通过多信息整合提高了注释置信度。
**结论部分翻译**：
在本研究中，研究人员开发了一种基于DIA的MALDI MSI工作流程，该流程将空间分辨的MS1成像与互补的DIA MS2碎片信息相结合。该方法整合了随机化DIA采集、前体关联的MS2分析以及空间信息引导的注释策略，在扩展的Compound Discoverer工作流程中实现。应用于肝片吸虫（Fasciola hepatica）组织的结果表明，结合前体质量信息、DIA MS2谱图和空间相关性过滤，相比于仅基于MS1的MSI，能够改善化合物和脂质组的注释。同时，该研究强调了由DIA窗口设计引起的谱图复杂度、空间采样密度和有效空间分辨率之间的重要方法学权衡。尽管所提出的工作流程未提供完整的DIA谱图反卷积或所有化合物的明确结构解析，但它证明了DIA碎片信息可以有效地整合到MSI工作流程中，以支持空间分辨的化合物注释和回顾性数据分析。
