《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：An m/z- and Intensity-Based HRMS Clustering Algorithm Targeted toward Single-Cell Metabolomics
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单细胞（SC）代谢组学在新型诊断工具开发与细胞生物学机制洞察方面具有巨大潜力。利用高分辨率质谱（HRMS），可以以足够高的精度测定单细胞组分的质量，从而推导其元素组成。利用分子质量及其质谱（MS）碎裂模式，在许多情况下可以分配分子结构或在数据库中查找。由于轨道
单细胞（SC）代谢组学在新型诊断工具开发与细胞生物学机制洞察方面具有巨大潜力。利用高分辨率质谱（HRMS），可以以足够高的精度测定单细胞组分的质量，从而推导其元素组成。利用分子质量及其质谱（MS）碎裂模式，在许多情况下可以分配分子结构或在数据库中查找。由于轨道阱（Orbitrap）HRMS仪器的测量细胞体积较小，样品需要多次扫描，这需要在每个样品内进行跨扫描聚类，并对质荷比（m/z）值进行跨样品比对。然而，现有的HRMS数据处理软件并非设计用于处理SC HRMS数据，因为其通常需要液相色谱保留时间或参考光谱来进行m/z聚类和比对。本文提出一种新颖、稳健的SC HRMS m/z聚类与比对算法，并与Sciex MarkerView和Thermo FreeStyle使用的两种商用行业标准算法进行比较。此外，将输出结果与DBSCAN和MaldiQuant分箱（binning）的聚类结果进行对比。研究人员提出的算法Global Clustering unTargeted Analysis（GCTA）强制执行严格的簇大小上限，从而减少峰聚合（peak aggregation）的可能性。此外，GCTA在设计上能够根据强度和峰数量进行噪声过滤。研究人员对比了跨扫描聚类和跨样品比对在查找商用软件输出识别的峰以及对应于标准品、HMDB和LipidMaps数据库匹配的已知m/z值方面的准确性。比较基于包含标准品混合的质量控制（QC）样品数据以及记录的两种不同细胞系的SC HRMS数据。本工作表明，该算法在与MarkerView和FreeStyle的准确性相当，能可靠识别化合物，比MaldiQuant分箱更不易发生峰分裂（peak splitting），同时在聚类峰误差水平上提供相似表现，并成功过滤噪声。此外，基于数据库匹配的理论m/z值比较显示，GCTA与DBSCAN、MaldiQuant分箱和MarkerView相比具有竞争力。GCTA涵盖了m/z聚类和无参考（reference-free）比对，这对非靶向SC HRMS代谢组学的进一步发展至关重要。
研究背景与意义
细胞是生命的基本单位，即使遗传信息相同，每个细胞也具有异质性，这种单细胞异质性对疾病亚型及治疗反应具有重要意义，因此需要能够分析单细胞的分析平台。单细胞代谢组学旨在研究由细胞内化学反应转化或产生的所有小分子组成的代谢组，但因分析物浓度低、样品体积小及代谢物结构化学多样性大而使分析复杂化。高分辨率质谱（High-Resolution Mass Spectrometry, HRMS）因其高灵敏度和准确性成为单细胞代谢组学的首选分析平台，但HRMS单细胞代谢组学在数据处理与分析方面面临独特挑战。在单细胞代谢组学中，活贴壁细胞通常在显微镜下使用微操纵器和铂涂层玻璃毛细管采样，收集的细胞使用直接注入HRMS分析，多在Orbitrap仪器上进行。由于系统高分辨率和m/z值轻微差异，同一化合物在不同扫描中出现需进行跨扫描聚类，不同细胞间也需跨样品比对m/z值。若聚类与比对不当，同一化合物的不等m/z值被视为不同特征，导致数据矩阵膨胀并使下游特征识别失败。现有代谢组学HRMS数据处理工具如METASPACE因单细胞数据噪声大而不推荐通用；为液相色谱-质谱（Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, LC–MS）开发的算法如GridMass和感兴趣区域搜索通常需要保留时间数据和连续光谱关系，不适用于单细胞HRMS数据。当前聚类方法依赖分箱（binning），即定义数据轴边缘将数据点分组，分箱质量依赖边缘选择，易导致峰分裂或信息丢失及质量准确度下降。密度聚类如DBSCAN和OPTICS沿轴寻找信息密集区，但依赖用户定义搜索半径和最大点数，影响非靶向实验结果，且密度连通性易导致簇聚合丢失信息。这些算法在m/z聚类中通常不考虑强度。聚类后跨文件比对通常需要参考光谱，而单细胞分析样品通常消耗殆尽无法获取，且样品量有限无法生成混合样。商用算法如Thermo FreeStyle和Sciex MarkerView属专有软件，内部机制未知。因此，研究人员开展了本研究，提出一种新颖的聚类与比对算法Global Clustering unTargeted Analysis（GCTA）并应用于ThermoFischer Orbitrap Exploris 480仪器记录的单细胞代谢组学数据，以解决现有问题。该研究发表于《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》。
主要关键技术方法
研究人员使用ThermoFischer Orbitrap Exploris 480仪器生成数据，扫描范围m/z 50–1100，使用全自动增益控制目标120,000及射频漏斗40%至60%，正负模式分开处理。样本包括19个含Pierce FlexMix校准溶液的质量控制（QC）样品及10个HEK293T细胞和10个HepG2细胞的单细胞HRMS数据。原始.raw文件经R包mzR转为.mzML，采用Savitzky–Golay滤波平滑，窗口大小5、多项式阶数3，随后质心化。GCTA算法以R编程并提供Python实现，含GCTAn（跨扫描聚类）与GCTAp（跨文件比对）两函数；参数定义包括最大测量误差eps（跨扫描3 ppm、跨样品5 ppm）、最大邻点数K、m/z轴对数变换底数、分数阈值及邻域分数计算函数。验证对比MaldiQuant分箱和DBSCAN（eps同GCTA，最小点数2），基准为理论标准m/z、Thermo FreeStyle提取m/z、Sciex MarkerView提取m/z及HMDB和LipidMaps数据库匹配；误差分布用Freedman-Diaconis规则确定箱宽并以对数x轴展示，进行正态性、方差齐性及显著性统计检验，评估峰分裂发生频率及对注释率影响，并评估分数阈值对噪声过滤与注释数的影响。
研究结果
Validation─Comparison with Standards
研究人员将标准混合物组分的聚类m/z值与Thermo FreeStyle和Sciex MarkerView输出对比，在正模式和负模式结果中，DBSCAN在跨扫描聚类的表现略差于GCTA和分箱，GCTA与分箱表现非常相似，曲线重叠度高，所有算法误差均在Orbitrap质量分析器预期范围内。
Validation─Comparison of Across-Scan and Across-File Clustering with Commercially Available Software
研究人员用Thermo和MarkerView提取的m/z值作参考，对比GCTA、分箱和DBSCAN的跨扫描聚类和跨文件比对准确性。结果显示GCTA与分箱表现相似，DBSCAN表现较差；仅考虑低于5 ppm误差时DBSCAN表现略好于GCTA和分箱，但满足精度阈值的簇数量显著少于GCTA和分箱。跨文件比对显示DBSCAN优于GCTA和分箱，GCTA略优于分箱。
Validation─Occurrence of Peak Splitting in GCTA, Binning and DBSCAN Clustering and its Effect on Annotation Rate
研究人员调查跨扫描聚类中峰分裂情况，发现正模式下GCTA显著更可能保持峰完整，分箱更易分裂；负模式无显著差异。DBSCAN比GCTA更不易发生峰分裂。因峰分裂导致的错失注释数量，GCTA在正负模式及HMDB和LipidMaps数据库中均低于分箱，具统计显著性。
Validation─Comparison of Across-File Clustering with HMDB and LipidMaps Database Hits
研究人员将HEK和HepG2细胞MS数据的跨文件比对结果与HMDB和LipidMaps数据库比对，每个聚类m/z仅取质量最接近数据库匹配。结果显示GCTA与DBSCAN在正负模式表现非常相似，四种算法总体表现相近，LipidMaps数据库误差趋势一致。
Assessment of Noise Filtering and its Effect on Annotation Rate
研究人员评估GCTA分数阈值的噪声过滤效果，增加阈值去除低分邻域，发现注释数随阈值升高先缓后速降；被去除的数据点强度趋于更高，但几乎所有阈值下低强度点被去除而高强度点保留，阈值约3时可滤除多为噪声且几乎不影响注释数。
讨论与结论翻译
HRMS是单细胞代谢组学研究的首选技术，但缺乏适用于非靶向SC HRMS数据的m/z聚类和比对技术制约数据处理；同一化合物因扫描间或样品间变异具轻微不同m/z值可被误认为不同化合物，使特征识别不可能。现有聚类算法易分裂或聚合峰，比对技术通常需参考光谱而无法用于单细胞代谢组学，峰分裂与聚合导致峰识别m/z不准确并暗示化合物数量误判。为此聚焦m/z数据聚类与比对，GCTA算法同时以极相似方式进行跨扫描聚类和无参跨文件比对，且通过邻域排名分数阈值选择使用户能滤除噪声。GCTA输出主要取决于K和eps值选择，可基于实验设置初估并通过对比原始光谱与聚类结果视觉优化。应用GCTA后可生成列出各样品各m/z值强度的数据矩阵以供分析。图4与附图S7比较显示DBSCAN在跨扫描聚类中略准于GCTA，但仅在大误差移除后成立，正副模式皆然，亦反映于图3与表S1，可能因DBSCAN峰聚合：GCTA借恰当K防聚合，DBSCAN可能将多个紧密高密度区视为一峰致大聚类误差；GCTA中未超分数阈值的邻域被移除，防止稍密噪声区被纳入为峰。图5显示跨文件聚类m/z值准确性GCTA和分箱与DBSCAN差异较大，DBSCAN在m/z值比对上优于GCTA和分箱，但GCTA主要为聚类算法，其跨扫描聚类m/z值比对函数可由用户调优使结果更接近MarkerView分箱；当比对结果对比代谢组学数据库理论值时，GCTA与DBSCAN表现极相似，故图5结果可能因DBSCAN更接近MarkerView排序分箱而非更接近真实m/z值。附图S8显示正模式分箱比GCTA更易峰分裂，负模式无此差异，或因负模式检测峰少，峰位于分箱边缘概率降低而分裂程度减小，GCTA防分裂优势被抵消；DBSCAN较GCTA不易峰分裂，因DBSCAN更易将数据点簇识别为峰而识别更多峰，降低峰分裂频率。图7显示GCTA较分箱错失注释少，证明GCTA适于SC HRMS数据。图6与附图S7显示算法跨文件比对精度表现相似，分箱和MarkerView略优于GCTA和DBSCAN，后者极相似，负模式无此趋势，故不能强烈偏好任一算法。最后分数阈值选择对滤噪与注释影响研究显示阈值约3多滤噪且罕影响注释数，被滤除数据点强度显示多为恰在数据库5 ppm内的噪声数据点；分数阈值给予用户筛选噪声标准自由度，当前分数函数给成员少或强度低邻域较低值，使多次测量的低强度代谢物可保留，而少数扫描的高强度噪声被去除，这种数据聚类与噪声过滤集成使GCTA独特适于噪声HRMS数据如SC代谢组学。GCTA运行高效，普通PC加载预处理原始文件约需1秒，运行GCTAn约3秒每文件，GCTAp耗时相似但文件增多可能延长，可用更高分数阈值或跳过比对缓解内存问题。总之，GCTA适于非靶向HRRMS数据聚类比对：GCTA聚类和比对各自相对商用算法高度准确，较分箱不易峰分裂，其与代谢组学数据库匹配的聚类误差与DBSCAN、MarkerView和分箱相当；且在m/z值聚类纳入强度开启更可靠定量之路，目前多仅用m/z值聚类，纳入强度可选定函数定聚类强度值以改善定量质量。GCTA实现非靶向SC代谢组学实验中HRMS m/z值无参聚类和比对，对该发展领域中至关重要。
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