《Journal of Chemical Information and Modeling》：Unveiling the KRAS Relationship between Affinity and Dynamics: A Molecular Simulations Study
编辑推荐：
Kirsten大鼠肉瘤病毒蛋白（KRAS）是当前药物发现中最重要的靶点之一。其内在特性，包括高结构灵活性和浅极性口袋，使得KRAS极难靶向。事实上，在很长一段时间内，它被认为是不可成药的。更好地理解其结构和动力学将有助于推进药物发现工作。KRAS是一种GTP酶
Kirsten大鼠肉瘤病毒蛋白（KRAS）是当前药物发现中最重要的靶点之一。其内在特性，包括高结构灵活性和浅极性口袋，使得KRAS极难靶向。事实上，在很长一段时间内，它被认为是不可成药的。更好地理解其结构和动力学将有助于推进药物发现工作。KRAS是一种GTP酶（GTPase），与细胞的生长、增殖和分化高度相关。已发现多种致癌突变，表明KRAS可能是对抗癌症的优秀靶点。在这项工作中，研究人员使用分子动力学模拟来突出该蛋白质在计算机药物设计中的挑战。研究人员首先表征了结构灵活性和观察到的分子相互作用的多样性。然后，研究人员量化了G12C突变体在活性GTP结合态稳定性增加的热力学原因。为此，研究人员使用了两个热力学循环，并发现alchemical突变产生了内部一致的结果，与生物学观察一致。此外，研究人员探索了使用加速包络分布采样（A-EDS）来高效筛选具有最强结合亲和力的一小部分片段。A-EDS的筛选模式已经允许识别最有利的候选分子。随后，进一步优化A-EDS参数有助于以自由能的形式量化相对结合亲和力。
KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒蛋白）是Ras家族小GTP酶（GTPase）的重要成员，介导细胞生长、增殖和分化等关键信号通路。然而，其高结构灵活性和浅极性口袋导致靶向极其困难，历史上曾被认为是“不可成药的”靶点。尽管针对G12C（第12位甘氨酸突变为半胱氨酸）突变体的抑制剂已取得进展，但其他常见致癌突变仍缺乏有效药物。现有研究在评估KRAS的热力学性质（如结合自由能）时面临挑战：蛋白质的灵活性导致不同状态行为差异显著，自由能测量可能不一致，亟需内部一致性校验。为此，研究人员开展了这项研究，旨在通过分子动力学模拟系统分析影响KRAS与小分子抑制剂结合亲和力的因素，特别是灵活性、G12C突变效应以及结合亲和力的计算方法。
研究人员使用分子动力学模拟（MD simulation），从PDB（蛋白质数据库）代码8AFC的晶体结构出发，构建了野生型（WT）和G12C突变体的KRAS模型，分别结合GDP（二磷酸鸟苷）或GTP（三磷酸鸟苷），并模拟了有无化合物12（一种抑制片段）的Holo/Apo状态。每个系统进行了5次独立的1微秒模拟。研究结果发表在《Journal of Chemical Information and Modeling》。
主要关键的技术方法包括：分子动力学模拟（使用GROMOS11和GROMACS软件包，GROMOS 54A8力场，SPC水模型）；自由能计算采用自由能微扰（FEP）结合Bennett接受率（BAR）方法，通过alchemical突变计算相对结合自由能；加速包络分布采样（A-EDS）用于高效筛选和量化片段结合亲和力，通过构建单个参考状态同时采样多个化合物；分析工具包括gromos++和MDpocket（用于口袋表征）。样本来源为PDB代码8AFC的晶体结构（KRAS G12C突变体与GDP和化合物12复合物）。
研究结果如下：
**开关环的灵活性（Flexibility of the Switch Loops）**
通过原子位置均方根涨落（RMSF）分析，发现sI（开关I）和sII（开关II）环区域（残基30-40和58-72）波动最大。G12C突变体与GTP和化合物12结合时，sII环的灵活性显著降低，表明化合物12稳定了该区域。
**KRAS中的动态口袋（Dynamic Pockets in KRAS）**
使用MDpocket分析了sII口袋和sI/sII区域。在Apo模拟中，sII口袋体积较小（0.0-4.0 nm3），形状不规则；而在Holo模拟中，体积增大（0.2-1.0 nm3），更接近球形。sI/sII区域体积较大但较浅，溶剂可及性高，疏水性低，不利于药物设计。
**分子相互作用（Molecular Interactions）**
距离热图和氢键分析显示，G12C突变体中的Cys12与GTP的γ-磷酸形成稳定氢键（发生频率高），而在与GDP结合时相互作用较弱。这为G12C突变体倾向于活性GTP结合态提供了分子解释。化合物12与sII环的Glu63等残基形成动态氢键，但不同复制间存在多样性。
**G12C突变对核苷酸亲和力的影响（Effect of G12C Mutation on the Nucleotide Affinity）**
通过自由能计算，研究人员构建了热力学循环并比较了前向和后向模拟。虽然GDP到GTP的alchemical变换在蛋白质中因电荷变化导致不一致，但Gly到Cys的alchemical突变内部一致，允许量化相对结合自由能。计算表明，G12C突变使GDP结合减弱3.2 kJ mol?1，使GTP结合增强4.9 kJ mol?1，整体稳定GTP结合态约-8.1 kJ mol?1，与G12C的致癌效应一致。
**小片段配体的相对结合自由能（Relative Binding Free Energy of a Small Set of Ligand Fragments）**
使用A-EDS方法，研究人员将六个结构相似的片段（化合物1、3、6、11R、11S、12）合并为单个参考状态。首先在溶剂中优化参数，然后在蛋白质环境中进行筛选模拟，发现化合物12、11R和11S采样频率显著更高，表明其结合亲和力最强。进一步在蛋白质中优化偏移参数后，量化了相对结合自由能（ΔΔG
bind），结果与Br?ker等人报告的实验K
D值趋势一致（化合物12 < 10 μM，化合物11约20 μM，化合物1、3、6分别为116 μM、715 μM和>2000 μM）。
讨论部分指出，MD模拟揭示了G12C突变稳定活性状态的分子机制：Cys12与GTP的氢键是关键。自由能计算中，GDP到GTP的alchemical变换因电荷变化和结构重排导致不一致，强调了内部一致性测试的重要性。而Gly到Cys的突变计算内部一致，可靠地量化了突变效应。A-EDS方法有效克服了KRAS灵活性带来的挑战，通过单一模拟即可筛选和量化结合亲和力，避免了大量中间态模拟。
研究结论（翻译自原文）：
通过使用分子动力学模拟，研究了KRAS及其G12C突变体的构象灵活性和相互作用潜力。研究人员从分子和热力学观察角度合理化了G12C突变体活性状态的致癌稳定性。蛋白质的显著灵活性以及不同相关状态（核苷酸或抑制剂结合）之间的行为差异，对评估热力学性质（如结合自由能）提出了额外挑战。因此，研究人员探索了使用替代热力学循环和更高效自由能方法的可能性。KRAS致癌活性状态的稳定性增强可归因于G12C突变体中Cys12与核苷酸GTP的增强相互作用。Cys12与GTP的γ-磷酸之间的氢键导致了该状态的稳定，这可以通过在模拟中通过alchemical进行突变来量化。此外，研究人员使用A-EDS方法根据结合亲和力对六个小片段进行了分类。A-EDS的筛选模式正确识别了三个结合最紧密的片段，并且在结合状态下进一步优化A-EDS参数使得能够量化这些化合物的相对结合自由能。总体而言，研究人员的工作展示了分子模拟如何有助于理解分子药物设计中的复杂靶点。A-EDS方法用于筛选少量结合物的亲和力是一种有前景的方法，它规避了更复杂的自由能方法中的各种问题。最佳分子可以通过执行单个模拟从一组中选出，无需大量模拟或对蛋白质中的参数进行广泛优化。
