蛋白质受挫揭示GPCR:G蛋白复合物中的正构与别构活性位点

《Journal of Chemical Information and Modeling》：Protein Frustration Reveals Orthosteric and Allosteric Active Sites in GPCR:G Protein Complexes

　　

蛋白质的折叠结构通常被理解为最优能量状态。然而，既往研究表明，在蛋白质功能中发挥关键作用的某些氨基酸残基位点，往往处于次优能量状态，即“受挫（frustrated）”状态。在本研究中，研究人员利用1200余个G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）的三维结构，证明GPCR与其配体或G蛋白之间界面上的残基，相较于受体其他结构区域，具有更高密度的高受挫残基。类似地，异源三聚体G蛋白的Gα亚基表面也显示出多个高受挫残基簇，这些区域与其效应蛋白〔Gβγ、RGS、腺苷酸环化酶（Adenylyl cyclase）、Ric8〕结合界面相重叠。本研究强调，蛋白质受挫可作为识别蛋白质-蛋白质界面并前瞻性预测潜在配体结合位点的多种结构性质之一。

该论文发表于《Journal of Chemical Information and Modeling》，核心目标是评估蛋白质受挫（protein frustration）这一局部能量学特征，能否系统性揭示G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）及其G蛋白复合物中的功能界面、正构配体结合位点与别构调节位点。蛋白质折叠通常趋向自由能最低状态，但局部区域可能因竞争性相互作用而停留在次优能量状态，即“受挫”状态。既往研究已提示，这类高受挫区域往往与配体识别、构象变化、催化或蛋白质-蛋白质相互作用有关。GPCR作为人类基因组中最大的膜蛋白超家族，也是药物研发中最重要的靶标家族之一，其跨膜骨架高度保守、构象状态多样、配体识别模式复杂，因此如何从结构层面识别功能位点，特别是别构位点，始终是理性药物设计中的难点。研究人员因此开展本研究，试图建立一种基于大规模结构数据库的受挫图谱分析框架，以辅助识别GPCR及G蛋白复合物中的功能热点。

在方法学上，研究人员收集了截至2024年8月15日GPCRdb与GproteinDB中的结构数据，包括1283个GPCR三维结构与636个Gα相关结构，覆盖A、B1、B2、C、D、F类GPCR以及多种Gα亚型和不同活化状态。随后采用FrustratometeR软件、基于AWSEM粗粒化力场（coarse-grained force field），计算残基对受挫指数，并进一步换算为单残基高受挫密度、最小受挫密度与中性受挫密度；再结合通用编号体系、ROC分析、序列保守性与共进化分析、fpocket口袋识别、AlphaFold3（AF3）模型对照，以及已发表功能与热稳定性数据进行综合评估。实验验证数据主要来自AT1R丙氨酸扫描功能测定及A_2AR、β₁AR、NTSR1等受体的热稳定性扫描数据。

Results

A Protocol to Calculate Average Frustration per Residue from Multiple GPCR Structures
研究首先建立了一个跨多结构平均受挫分析流程。研究人员对1283个GPCR结构中的全部残基对进行FrustratometeR计算，根据z-score将残基对划分为高受挫（HF）、中性受挫（NF）和最小受挫（MF），并以5 ?范围内邻近残基对的受挫类型比例定义单残基受挫密度。随后利用各类GPCR的通用编号体系进行结构对齐，在位点层面获得平均受挫密度。这一流程为不同家族、不同构象和不同实验来源结构之间的横向比较提供了统一基础。

Frustration Is Correlated to Experimentally Measured Function and Stability in Class A GPCRs
在A类GPCR中，研究人员发现高受挫残基主要富集于GPCR:G蛋白界面及细胞内环区域，而最小受挫残基则主要集中在跨膜螺旋核心。该空间分布提示高受挫更可能对应功能活动，最小受挫则更多反映结构稳定性。为验证这一点，研究使用AT1R的丙氨酸扫描功能数据进行ROC分析，发现基于受挫密度的预测对Gα_q偶联功能变化具有中等区分能力，AUC为0.65。进一步以A_2AR、β₁AR和NTSR1的热稳定性扫描数据分析最小受挫位点，得到平均AUC为0.66，表明最小受挫位点与实验定义的稳定性增强突变存在中等一致性。综合而言，高受挫位点偏向功能相关，最小受挫位点偏向稳定性相关，但两者并非绝对割裂。

进一步的结构分区分析显示，A类GPCR存在四个显著高受挫簇：GPCR:G蛋白界面、螺旋8（helix 8，H8）、钠离子结合位点以及靠近正构口袋的胞外跨膜区域。尤其TM5、TM6胞内端及ICL2、ICL3等区域高受挫明显，与这些区段在受体激活和G蛋白选择性中的已知作用相一致。

Effect of Different Crystallization Conditions and Constructs
为排除构建体设计和晶体条件对结果的干扰，研究人员比较了融合蛋白构建、热稳定突变、单体/二聚体等不同条件下A_2AR和μ-阿片受体的受挫分布。结果显示，60%—80%的高受挫和最小受挫位点在不同实验条件间是共享的，说明整体受挫图谱具有较好稳健性。进一步将实验结构与AF3预测模型比较，在多种生物胺受体中，约80%的高受挫位点和近90%的最小受挫位点能够被AF3模型重现，提示在已有同源结构支撑的情况下，预测模型亦可较好恢复局部能量学格局。

Frustration Patterns in Orthosteric Ligand Binding Sites in GPCRs
研究人员接着考察正构配体结合位点的受挫特征。由于A类GPCR正构口袋在不同受体中的具体位置和配体大小差异较大，跨全家族平均后，胞外正构位点的高受挫信号并不十分显著。但在肾上腺素能受体等亚家族内分析时，配体周围高受挫残基明显增加。进一步按配体类型和大小分组后发现，G蛋白界面与肽类配体界面相较跨膜非界面区域具有更高比例的高受挫残基；小分子激动剂结合位点高受挫程度高于小分子拮抗剂，而小分子拮抗剂位点甚至低于跨膜对照区域。该结果说明，激动剂结合位点可能需要更高构象柔性以支持由配体口袋向G蛋白偶联界面的变构通讯，而拮抗剂则更倾向于稳定受体失活构象。

Analysis of Frustration in Structures with Different Ligand Binding Poses
针对同一受体-同一配体但不同结合姿势的情形，研究以A_2A腺苷受体与拮抗剂ZM241385的31个共晶结构为例进行分析。结果显示，PDB 3PWH中的另类结合姿势对应若干接触残基更高的HF密度和更低的MF密度，提示不同配体姿势可伴随局部受挫状态改变，且非常规姿势往往与更高局部受挫相关。

Evolutionary Properties of Highly and Minimally Frustrated Residues in GPCRs
从进化层面看，研究基于287条人源内源性A类GPCR序列的多序列比对（MSA）进行保守性与共进化分析。结果表明，最小受挫残基的平均保守性约为40%，而高受挫残基约为20%，前者受到更强进化约束。相反，高受挫残基具有更高的共进化分数，约高于平均值1个标准差，提示其更可能参与补偿性或协同变化网络。由此可见，最小受挫位点更像维持骨架稳定的“结构锚点”，而高受挫位点则更符合动态功能模块的特征。

Other Classes of GPCR Show a Similar Signature of Frustration
研究将分析扩展到B1、B2、C、D、F类GPCR后发现，整体规律与A类相似：G蛋白结合区域和H8普遍具有高受挫特征，胞外结构域、环区及正构识别相关区域也常呈高受挫；而跨膜束中央则更多为最小受挫残基。唯一显著差异在于C类GPCR的正构位点位于胞外结构域而非跨膜束内部，因此其高受挫分布也相应转移到胞外结构域。这说明受挫信号并非A类GPCR特有，而是跨家族存在的功能结构共性。

The Protein–Protein Interface on the Gα Subunit Is Highly Frustrated
除GPCR本身外，研究还系统分析了Gα亚基中的受挫图谱。首先在GPCR:Gα界面上，TM3、TM5、ICL2与Gα的H5螺旋之间形成大量HF和MF残基对。特别是H5螺旋中段（H5.09-H5.19）富集高受挫对，而C末端尖端（H5.20-H5.26）富集最小受挫对，提示后者可能主要承担复合物稳定作用，前者则更多参与偶联选择性和核苷酸交换调控。

在GDP结合三聚体、GPCR结合中间态以及GTP结合单体态之间比较时，研究发现Gα_S和Gα_i-1均存在大量跨状态共享的高受挫位点。值得注意的是，在GDP结合“关闭”状态下，H5并不表现出高受挫，而高受挫主要集中在Ras样结构域与全螺旋结构域（all-helical domain，AHD）界面、Gα-Gβγ界面及其他功能性交互表面。这些区域恰与核苷酸释放、AHD运动、Gβγ结合解离以及RGS、Ric8、腺苷酸环化酶等效应蛋白结合有关。研究据此表明，Gα表面广泛分布的高受挫簇能够标记多重蛋白相互作用界面和变构通讯通路；相对而言，共享的最小受挫残基更多位于β₁、β₃、β₄、β₅和α₃等较稳定的有序结构区域，反映其结构支撑作用。此外，无论在GPCR还是G蛋白中，极性残基均倾向具有更高HF密度和更低MF密度，而非极性残基则更倾向于最小受挫，这与疏水核心稳定和功能表面极性富集的普遍规律一致。

Application of Frustration in Identifying Allosteric Modulator Sites in GPCRs
论文最后聚焦于别构调节位点识别这一药物设计关键问题。研究人员对所有含正变构调节剂（PAM）或负变构调节剂（NAM）的A类GPCR结构进行口袋聚类，分别识别出6类PAM位点与4类NAM位点。随后在未结合PAM/NAM的受体结构中评估这些位点的受挫特征，发现PAM位点具有较高比例的高受挫残基，而NAM位点则较低，类似于激动剂位点和拮抗剂位点之间的差异。基于这一现象，研究建立了别构位点预测流程：先用fpocket识别跨膜区域潜在口袋，再计算各口袋内残基平均HF密度，并据此排序。在具有已知PAM/NAM共晶结构的A类GPCR中，真实PAM位点通常位列高HF密度口袋前列，NAM位点则偏低。该结果表明，受挫分析能够作为识别GPCR别构口袋的有效结构特征，并可与虚拟筛选联用，服务于调节剂发现。相较之下，胆固醇结合位点受挫水平低于PAM和NAM位点，提示其更偏向构象稳定化作用。

讨论部分指出，本研究利用大规模已发表GPCR结构数据库，证明蛋白质受挫不仅能够标记经典正构配体位点和G蛋白偶联界面，还能够揭示别构位点等非内源性配体作用区域。高受挫残基集中于功能界面，最小受挫残基集中于稳定骨架，这一规律在实验功能、热稳定性和进化分析中均获得支持。对Gα亚基的分析进一步说明，受挫不仅适用于受体，也适用于多伙伴互作的信号转导蛋白。论文同时强调该方法的局限性，包括不同GPCR家族结构数量不均衡、PAM/NAM共晶结构样本有限，以及FrustratometeR基于AWSEM粗粒化力场、未显式考虑配体或氨基酸质子化状态等。因此，受挫分析更适合作为一种易于获取的结构筛查维度，并与更高分辨率的全原子计算方法联合使用。

研究结论部分可概括为：研究人员在1200余个GPCR结构及其G蛋白复合物中完成了残基水平受挫绘图，发现高受挫残基优先富集于GPCR的G蛋白偶联界面和配体结合位点，而最小受挫残基主要分布在跨膜螺旋中央稳定区域。高受挫位点与功能活性、构象柔性和共进化相关，最小受挫位点与结构稳定性和序列保守性相关。Gα亚基表面多个高受挫簇与GPCR、Gβγ、RGS、Ric8及腺苷酸环化酶等结合界面重叠。总体而言，残基特异性能量景观分析为理解动态蛋白质-蛋白质界面提供了有力工具，并为靶向GPCR正构与别构位点以及G蛋白功能界面的治疗策略设计提供了新的结构依据。