Diacarnusins A-F，红海海绵Diacarnus erythraeanus的去甲萜烯内过氧化物

《Journal of Natural Products》：Diacarnusins A-F, nor-Terpene Endoperoxides of the Red Sea Sponge Diacarnus erythraeanus

　　

从红海海绵Diacarnus erythraeanus的提取物中分离出六种新的去甲萜烯内过氧化物，diacarnusins A–F (1–6)，以及五种已知化合物 (7–11)，该提取物表现出对结肠癌细胞系的细胞毒性活性。通过质谱分析和一维及二维核磁共振（NMR）数据进行结构解析。基于Capon和Macleod经验规则以及将比旋光度符号与已确定绝对构型的内过氧化物进行比较，推断了化合物立体中心的相对和绝对构型。评估了纯化合物对一组癌细胞系的细胞毒性。讨论了化合物的结构解析和生物活性。

**论文解读：红海海绵Diacarnus erythraeanus中新型去甲萜烯内过氧化物Diacarnusins A-F的分离、结构鉴定与细胞毒性研究**

**研究背景与问题**

海洋海绵是天然产物的重要来源，其中去甲萜烯内过氧化物（nor-terpene endoperoxides）因其独特的化学结构和广泛的生物活性（如抗肿瘤、抗疟、抗真菌等）而受到关注。自1979年从红海海绵Diacarnus erythraeanus（当时鉴定为Prianos sp.）中首次分离出muqubilin以来，已有超过70种不同结构的去甲萜烯内过氧化物从Diacarnus、Sigmospecterella、Negombata等属海绵中被发现。然而，这类化合物的结构多样性、立体化学确定以及构效关系仍需进一步探索。特别是，红海不同地点的D. erythraeanus样本中已报道了15种不同的去甲萜烯内过氧化物，但仍有新化合物和活性成分有待发掘。本研究旨在从以色列红海沿岸采集的D. erythraeanus海绵中分离具有细胞毒性的次级代谢产物，并阐明其结构及生物活性。

**研究内容与结论**

研究人员从红海海绵D. erythraeanus的提取物中分离并鉴定了11种去甲萜烯内过氧化物，包括6个新化合物diacarnusins A–F (1–6) 和5个已知化合物sigmosceptrellin B (7)及其甲酯 (8)、diacarperoxide A (9)、methyl diacarnoate A (10)和(?)-ent-muqubilone (11)。通过分析质谱和¹H、¹³C NMR数据，结合二维NMR（COSY、HSQC、HMBC）确定了平面结构；利用Capon和Macleod经验规则以及比旋光度符号比较，确立了所有新化合物的相对和绝对构型。其中，化合物1（diacarnusin A）和7（sigmospectrellin B）对一组癌细胞系（包括宫颈癌C33A、结直肠癌HCT116、黑色素瘤A375、前列腺癌LNCaP、肺癌A549、宫颈癌HeLa和结直肠癌HT29）以及转化的人胚肾细胞293T表现出微摩尔级的细胞毒性（IC₅₀在0.82–3.12 μM范围内），而其他化合物活性显著降低或无效。此外，化合物3和4在溶液中自发转化为两种异构体（3a、3b和4a、4b），其结构被鉴定为羟基环氧衍生物，这一转化过程可能揭示了内过氧化物产生自由基的作用机制。该研究不仅丰富了去甲萜烯内过氧化物的结构多样性，也为开发抗癌先导化合物提供了新候选物。论文发表在《Journal of Natural Products》。

**关键技术与方法**

研究人员采用以下关键技术：样品采集自以色列埃拉特红海（2019年7月，水深6米），经冷冻干燥后提取；利用反相C18柱（CombiFlash EZ Prep系统）和Sephadex LH-20尺寸排阻色谱进行细胞毒性引导的分离纯化；通过高分辨质谱（HRESIMS）和一维/二维核磁共振（NMR，500 MHz）进行结构解析；基于Capon和Macleod经验规则（通过¹H和¹³C NMR化学位移判断内过氧化物环的相对构型）和比旋光度比较确定绝对构型；使用CellTiter-Glo法在7种人癌细胞系和1种正常细胞系上评估细胞毒性，数据采用非线性回归拟合IC₅₀。

**研究结果**

**Diacarnusin A (1)**：通过NMR数据与已知化合物7对比，发现其平面结构相同，但比旋光度为正（+17.5）而7为负（?48.4），结合Capon-Macleod规则，确定其内过氧化物部分具有2S,3R,6S绝对构型。

**Diacarnusin B (2)**：NMR数据与已知化合物diacarperoxide A (9)相似，但发现一个乙烯基甲基被乙烯基亚甲基取代。通过化学位移比较和比旋光度（+18.5 vs +43.8），确定其绝对构型为2R,3R,6R。

**Diacarnusin C (3) 和 Diacarnusin D (4)**：为小分子去甲萜烯内过氧化物（C₁₃H₂₀O₅和C₁₄H₂₂O₅），4是3的甲酯衍生物。NMR数据表明其C-2/C-3为反式（threo）相对构型，C-6位甲基为轴向。比旋光度为负（?12.0和?5），与已知化合物negombatoperoxide B（正旋光）相反，确定绝对构型为2R,3S,6R。值得注意的是，3和4在DMSO-d₆中自发转化为两种异构体（3a/3b和4a/4b），经NMR鉴定为3-羟基-6,7-环氧衍生物，其中3a/4a为E构型，3b/4b为Z构型。

**Diacarnusins E 和 F (5 和 6)**：以约2:1混合物形式分离，分子式为C₁₆H₂₄O₆，包含一个γ-内酯结构。NMR数据与已知的negombatoperoxides C和D相似，但关键甲基化学位移（CH₃-14 δ_H 1.27, δ_C 13.2；CH₃-15 δ_H 1.24, δ_C 21.1）表明C-2/C-3为反式构型且C-6甲基为轴向，与negombatoperoxides C/D的顺式构型不同。比旋光度为负（?22.3），与化合物3一致，确定绝对构型为2R,3S,6R。

**细胞毒性结果**：仅新化合物1和已知化合物7对全部测试细胞系显示微摩尔级活性（IC₅₀ 0.82–3.12 μM），且无选择性。化合物8（7的甲酯）活性降低约10倍，化合物10活性降低约100倍，其余化合物（2、3、4、5/6、9、11）在最高浓度100 μM下基本无活性。这表明内过氧化物部分是活性药效团，但decalin骨架（或环己烷环）对于靶向细胞至关重要。

**总结讨论与结论**

讨论部分提出，香叶基法尼基焦磷酸（GFP）是所有去甲萜烯内过氧化物的前体，通过环化生成decalin、环己烷或线性二倍半萜等中间体，再经氧化、末端双键丢失碳原子和过氧化生成不同系列产物。活性代谢物可能进一步被氧化酶降解为无活性产物。化合物3和4的自发转化支持了内过氧化物易产生氧自由基并异构化为碳自由基的机制，这些自由基可能攻击膜、蛋白质和DNA。

**结论翻译**：总之，从红海海绵D. erythraeanus的提取物中分离出六种新的去甲萜烯内过氧化物diacarnusins A–F (1-6)以及五种已知的去甲萜烯内过氧化物，并阐明了它们的结构。只有新的去甲二倍半萜内过氧化物diacarnusin A (1)表现出与已知化合物sigmosceptrellin B (7)相当的显著细胞毒性。