基于超薄Pd-NPs-酶薄膜的界面限制型电流型胆固醇生物传感

《Langmuir》：Interface-Limited Amperometric Cholesterol Biosensing in Ultrathin Pd-NPs-Based-Enzyme Films

　　

该手稿研究了一步法设计的电流型胆固醇生物传感器中酶与电催化剂耦合的局限性。从Pd-ChOx-Nafion电解液中进行一步电沉积产生了一种生物无机杂化传感层，同时保留了酶的天然构象和生物催化活性。尽管Pd与ChOx之间存在结构耦合，电流响应仍然由酶促H₂O₂的产生所主导，表明ChOx与电极之间的直接电子通信并未建立。更具体地，研究人员表明，即使在超薄电沉积纳米结构薄膜中，直接电子转移（DET）也无法发生，这可能是由于氧主导的电化学反应所致。此外，使用Pd-NPs/ChOx/Nafion修饰电极进行胆固醇测定的灵敏度与层厚度和结构无关，突出了Pd-NPs-酶界面的局限性。这些发现为超薄酶-电催化剂界面提供了机制上的见解，并有望对下一代胆固醇生物传感器的开发产生影响。

基于胆固醇氧化酶（ChOx，一种催化胆固醇氧化的酶）的电流型生物传感器在胆固醇检测领域面临重大挑战。这主要是因为胆固醇在水中的溶解度极低，ChOx的固定化能力差，其在电极表面的构象结构易发生改变，且在用于溶解胆固醇的含表面活性剂环境中活性容易下降。此外，胆固醇本身不具备电化学活性，检测完全依赖于捕获酶促反应中产生的副产物过氧化氢（H₂O₂）。然而，H₂O₂的氧化电位较高，必须引入电催化剂（如Pd-NPs，即钯纳米颗粒）以加速其分解。同时，为增加胆固醇溶解度而添加的表面活性剂会引起严重的基质效应，掩盖H₂O₂信号并导致酶不可逆失活。为了克服上述限制，研究人员探讨了通过多电解质溶液进行一步电沉积构建环保界面杂化层的策略。理论上，此超薄膜可缩短电子转移距离并有望实现酶-电极界面的直接电子转移（DET，即电子在不借助媒介体的情况下直接从酶的活性中心传递到电极）。尽管已有研究表明纳米结构贵金属电极能促进DET，但ChOx的结构特性以及氧还原反应（ORR，即溶液中的氧气在电极表面发生的还原反应）的竞争使得其实际机制仍不明确。因此，开展本研究旨在揭示这些超薄杂化层中酶-电催化剂耦合的机制与局限性。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了一步电沉积法在氧化石墨烯修饰的丝网印刷电极上制备了包含Pd前驱体、ChOx和Nafion（一种全氟磺酸聚合物粘结剂）的杂化传感薄膜。研究运用了石英晶体微天平（QCM）和原子力显微镜（AFM）来量化沉积层的质量与纳米级厚度；借助透射电子显微镜（TEM）确认了Pd-NPs与酶的共沉积形貌；通过循环伏安法（CV）和电流分析法（AM）在含氧及无氧缓冲液中评估了电极的电化学动力学和传质过程；并利用微型光纤氧传感器监测反应中的氧气消耗，以标定酶促反应动力学。

**一步法设计的Pd-NPs/ChOx/Naf基电极的表征**
通过TEM和AFM观察与测量，研究人员确认在均一的有机基质中嵌入了尺寸为20-30 nm的Pd-NPs，杂化层的平均厚度约为18.4 nm，QCM测量结果也证实了该纳米级别的超薄特征。这种超薄构型理论上可缩短电子转移距离并促进DET。随后通过在不同扫速下进行CV测试，发现在有氧环境中，阴极峰值电流（I_pc）显著大于阳极峰值电流（I_pa），呈现出由表面吸附主导的电子转移特征及不对称的电荷转移动力学，这是由于Pd表面氧化物的形成与还原以及背景ORR的巨大贡献共同导致的；而在无氧条件下，这种电流不对称性消失，表明氧的存在严重扭曲了电极的电分析功能。

**Pd-NPs/ChOx/Naf修饰电极在胆固醇溶液中的电分析性能：电催化剂还是酶的限制？**
在电化学表征与H₂O₂传感性能测试中，CV曲线表明ChOx在共沉积后保留了催化活性，能原位生成H₂O₂并被Pd-NPs有效电氧化。通过对比酶促产物与外加纯H₂O₂的信号差异，研究人员证实Pd-NPs的催化位点充足且并非性能瓶颈。为了排除电催化剂物理性质的影响，研究人员通过延长沉积时间改变了Pd-NPs的负载量及其电化学活性面积（ECSA），发现电极对H₂O₂的灵敏度几乎不受影响。因此，响应受限归因于酶促反应产生H₂O₂的电化学可寻址通量不足。

**OS ED Pd-NPs/ChOx/Naf修饰电极中酶负载的影响**
在评估酶负载量影响时，通过提高电解液中的ChOx浓度，研究人员发现溶液中的生化活性按比例增加，酶未发生局部失活。然而，尽管杂化层的厚度随酶浓度增加而线性增长，电极对胆固醇检测的灵敏度却几乎保持恒定。这一结果表明电极并未处于酶限制状态，其灵敏度独立于薄膜的厚度和整体加载架构。

**DET机制是否在超薄Pd-NPs/ChOx/Naf传感层中发生？**
为了查证DET是否存在，研究人员首先将ChOx的活性辅基黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）与Pd-NPs和Nafion共沉积。在无氧条件下，观察到了对称的FADH₂/FAD氧化还原峰，这是DET的经典电化学指纹；但在有氧条件下，该信号被ORR完全掩盖。当掺入含有内源FAD的ChOx时，即使在无氧环境中，特征信号也大幅减弱。若无外加FAD，仅依靠包含在ChOx内部的FAD，则完全检测不到DET信号。这表明蛋白质基质掩盖了深埋的FAD氧化还原中心，阻断了DET途径。

**揭示Pd-酶耦合界面局限性**
为验证界面限制假设，研究人员制备了微米级的层层涂覆结构电极并与超薄一步法电极进行对比。CV测试表明LbL电极表现为扩散控制过程，而OS ED为吸附控制过程。然而，两者对胆固醇的灵敏度和线性检测范围并无显著差异。增加层厚或酶载量未能提升信号，表明系统运行于界面限制的H₂O₂利用机制下。许多酶分子因未能与Pd-NPs建立有效的电通信而保持电化学惰性。

在讨论部分，研究人员总结道，即使在优化的纳米级架构下，氧相关反应的主导作用以及蛋白质对FAD活性中心的掩盖效应，从根本上限制了DET的发生。增加酶载量不能按比例提升性能，因为电化学响应的本质是由功能耦合的Pd-酶连接对的数量决定的，而非总酶量。发表在《Langmuir》上的本研究证实，增加功能化Pd-ChOx接触位点的数量，例如用更柔性的聚合物基质替代Nafion，将是改善下一代生物传感器性能的关键策略。