《Strahlentherapie und Onkologie》：Ro 08-2750 increases radiation-induced cytotoxicity in DLBCL by dysregulating the DNA damage response
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本研究旨在提高弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B?cell lymphoma, DLBCL)的治疗效果。近期，Musashi?2(Musashi?2, MSI-2)被确定为DLBCL中的阴性预后标志物及潜在治疗靶点。在此，研究人员评估了MSI
本研究旨在提高弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B?cell lymphoma, DLBCL)的治疗效果。近期，Musashi?2(Musashi?2, MSI-2)被确定为DLBCL中的阴性预后标志物及潜在治疗靶点。在此，研究人员评估了MSI?2抑制剂Ro 08-2750在DLBCL细胞中的作用。首先，研究人员通过细胞活力(cell viability)和克隆形成(clonogenicity)实验确定了Ro 08-2750对DLBCL的作用。通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡的变化。随后，研究人员评估了将放射治疗或化疗与Ro 08-2750联合使用时DLBCL治疗反应的改变。通过γH2AX实验证实Ro 08-2750增加了辐射诱导的DNA损伤后，使用基于免疫印迹(immunoblot-based)的实验检测辐射诱导的DNA损伤修复蛋白活化的变化。为了解Ro 08-2750诱导的基因表达和蛋白质丰度改变，研究人员进行了RT?qPCR、批量mRNA测序(bulk mRNA?sequencing)、蛋白质印迹(western blotting)和基于定量质谱的蛋白质组学分析。结果显示，Ro 08-2750降低了DLBCL的细胞活力和增殖能力。功能上，Ro 08-2750诱导S期细胞周期阻滞，其中DNA合成速率减弱。此外，凋亡增加。Ro 08-2750还能使DLBCL细胞系对辐射增敏，但对化疗无增敏作用，且增加了辐射诱导的DNA双链断裂(double?strand breaks)。转录组和蛋白质组分析显示多种肿瘤相关信号通路发生变化，主要将Ro 08-2750与受损的DNA修复、细胞周期和细胞分裂联系起来。研究人员确定Ro 08-2750是DLBCL中的一种放射增敏剂(radiosensitizer)。结果表明，Ro 08-2750与放射治疗联合可能会提高治疗效果。
本研究发表于《Strahlentherapie und Onkologie》。弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B?cell lymphoma, DLBCL)是最具侵袭性的淋巴瘤亚型之一，仍是癌症死亡的重要原因。局限期DLBCL患者5年总生存率可达90%，但晚期DLBCL结局较差，因此需要努力提高治疗疗效。标准治疗包括R?CHOP或类似的化疗免疫治疗方案，系统性治疗后PET阳性残留病变、结外受累或大肿块疾病患者可考虑巩固性放疗。RNA结合蛋白Musashi?2(Musashi?2, MSI?2)在生理干细胞发育中起关键作用，但在血液和实体恶性肿瘤中，Musashi蛋白表达失调与肿瘤侵袭性及不良预后相关，MSI?2在DLBCL中被确定为阴性预后标志物和潜在治疗靶点。小分子抑制靶向蛋白在临床应用中前景广阔，Ro 08?2750是最常测试的MSI?2抑制剂之一，但近期研究发现其存在非MSI?2相关的脱靶效应，需更好地理解其介导的基因表达变化。基于此，研究人员探究了Ro 08?2750对DLBCL细胞增殖、存活及对化疗和辐射耐受的影响。
研究人员使用人DLBCL细胞系HBL?1和HT开展体外实验。关键技术方法包括：通过MTT和RealTime?Glo MT细胞活力实验评估细胞活力；甲基纤维素集落形成实验评估克隆形成能力；DAPI染色流式细胞术分析细胞周期，BrdU掺入实验分析DNA合成，Annexin V?PI染色流式细胞术量化凋亡；γH2AX实验评估DNA双链断裂(double?strand breaks, DSB)及修复；免疫印迹法检测DNA损伤修复蛋白活化；RT?qPCR、批量mRNA测序(bulk mRNA?sequencing)分析基因转录，western blotting分析蛋白表达；定量质谱蛋白质组学分析蛋白质丰度变化；并通过SiPOOLs电穿孔进行MSI?2敲降作为对照比较。
Ro 08?2750 reduces cell viability in DLBCL
Ro 08?2750处理诱导剂量依赖性的细胞活力降低，近乎完全丧失细胞代谢，RealTime?Glo实验显示处理后立即出现生长模式差异并持续至少48小时，据此选用亚致死剂量5 μM(HBL?1)和1.5 μM(HT)作为处理浓度。集落形成实验显示Ro 08?2750在处理浓度下大幅减少集落形成，而MSI?2敲降后集落形成能力未降低甚至略有增加。
Ro 08?2750 induces cell cycle dysregulation and increases apoptosis
细胞周期分析显示Ro 08?2750处理后S期细胞比例显著增加，G2/M期减少，最大效应在48小时，72小时回归。BrdU实验显示BrdU+细胞平均荧光强度显著降低，提示S期DNA合成减少。Annexin V?PI流式凋亡实验显示48小时Ro 08?2750增加HBL?1和HT中早期凋亡细胞数量及HT中晚期凋亡/坏死细胞数量，24小时无显著变化。Western blotting显示细胞周期调节因子p21在HBL?1中降低，HT中无影响。
Ro 08?2750 increases radiosensitivity in DLBCL
集落形成实验显示Ro 08?2750在2 Gy和4 Gy照射后降低生存分数，具放射增敏效应。γH2AX实验显示4 Gy照射后多个时间点Ro 08?2750增加HBL?1中γH2AX+细胞量，HT在晚期时间点也确认此效应，无照射时对照组与处理组无差异。与长春新碱或阿霉素联用未观察到协同效应。DNA损伤实验及western blotting证实H2AX磷酸化增加，但CDC25A、CHK2磷酸化及乙酰化组蛋白H3减少，pCHK2下调。
Ro 08?2750 modulates gene expression involved in DNA damage response
批量mRNA测序分析HBL?1细胞显示Ro 08?2750显著失调939个RNA转录本。GO富集分析显示148条通路显著失调，其中52条(35.1%)与DLBCL细胞中靶向siRNA敲降MSI?2后的GO富集分析重叠，涉及DNA修复过程；Ro 08?2750独特失调的过程包含多条mRNA稳定性相关GO条目。过度代表通路包括“双链断裂修复”和“对电离辐射的反应”等DNA损伤相关通路及RNA稳定性、细胞周期信号、应激颗粒组装通路。
Ro 08?2750 dysregulates the DNA damage response in proteomic analyses
蛋白质组学分析显示0 Gy时Ro 08?2750导致74条GO生物学过程失调，4 Gy照射后38条，重叠24条(占照射条件所有通路的63.2%)，包括“DNA修复”和“细胞周期”下调。0 Gy与4 Gy条件下Ro 08?2750诱导变化的效应强度和方向性显著正相关，表明照射与否不改变Ro 08?2750诱导的蛋白质组失调。
讨论部分指出，Ro 08?2750降低DLBCL细胞活力和克隆形成能力与既往研究一致，最大效应在48小时，伴随早期凋亡诱导及细胞周期失调，本研究首次发现其引起S期阻滞而非G0/G1期，可能与DLBCL中p21无变化或降低及CHK2磷酸化减少有关，BrdU掺入减少提示DNA合成延迟。Ro 08?2750增加放射敏感性表现为生存分数降低及DNA双链断裂增加，与pCHK2下调相关，而对化疗无增敏可能源于DNA损伤能力下降与细胞周期减慢的抗性抵消。转录组和蛋白质组分析显示约三分之一通路与MSI?2敲降重叠，但也存在独特mRNA稳定性通路，支持其具MSI?2非依赖性脱靶效应及作用于多RNA结合蛋白。蛋白质组学首次证实其衰减关键DNA修复蛋白，放射与非放射条件下通路重叠及正相关表明照射不改变其诱导的蛋白失调。研究局限性在于Ro 08?2750特异性存疑及仅体外评估未评估对健康B细胞影响，但既往体内研究显示其耐受良好对造血无显著影响。其他MSI?2抑制剂亦存脱靶效应，需未来开发更特异性抑制剂。
结论翻译
总之，数据表明Ro 08?2750通过减弱DNA损伤修复信号传导，在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B?cell lymphoma, DLBCL)中充当放射增敏剂(radiosensitizer)。处理还降低细胞活力、增加凋亡并破坏细胞周期，整体在DLBCL细胞中诱导治疗上有利的变化。
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