DDRGK1介导的UFMylation系统抑制STAT3磷酸化从而缓解骨关节炎

《Journal of Advanced Research》：DDRGK1-mediated UFMylation system suppresses STAT3 phosphorylation to alleviate osteoarthritis

　　

信号转导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）的磷酸化在调控炎症因子分泌与软骨细胞退变中起关键作用，然而维持其稳态的机制尚不清楚。研究目的是明确DDRGK结构域包含蛋白1（DDRGK domain-containing protein 1, DDRGK1）介导的UFMylation系统作为STAT3磷酸化的关键调节因子在预防软骨退变中的作用。研究人员在对人软骨进行差异表达基因筛选与免疫荧光检测后，构建了软骨特异性Ddrgk1条件敲除（conditional knockout, cKo）小鼠及DDRGK1关键UFMylation位点K268R突变体。通过软骨组织学、RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）、蛋白质组学、磷酸化蛋白芯片、蛋白质印迹（Western blot, WB）、聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）及荧光素酶实验确认STAT3磷酸化上调。通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、纯化蛋白结合、交联联合质谱及免疫荧光探究STAT3磷酸化的调控机制，随后选用特异性抑制剂进行干预治疗。结果显示，DDRGK1在人退变软骨尤其是深层区显著下调；小鼠软骨细胞条件敲除Ddrgk1或K268突变会加重内侧半月板失稳（destabilization of medial meniscus, DMM）模型中的软骨退变。多组学分析揭示Ddrgk1敲除与K268R突变软骨细胞中STAT信号通路失调，以Il-6与Stat3为核心基因。交联质谱数据表明DDRGK1?K267与STAT3?K531介导直接的DDRGK1?STAT3相互作用，该区域突变会破坏相互作用。DDRGK1?K267介导STAT3及磷酸化STAT3的UFMylation，导致磷酸化受损及随后的核转位受抑。在人退变软骨中，DDRGK1表达下降与STAT3磷酸化及核转位增加相关；在小鼠模型中，软骨细胞Ddrgk1 cKo或K268R突变同样增强STAT3磷酸化与核转位。值得注意的是，STAT3磷酸化特异性抑制剂SH?4–54可有效挽救Ddrgk1 cKo小鼠的软骨退变。这些发现揭示了DDRGK1在调节STAT3活性与维持软骨稳态中具有新型的、依赖UFMylation的作用。

该研究围绕骨关节炎（osteoarthritis, OA）中软骨退变的分子机制展开。OA是一种常见的退行性关节疾病，全球患病人数超过五亿，给社会经济带来沉重负担。目前已知IL?6等炎症介质通过JAK2/STAT3信号通路参与OA进展，STAT3存在未磷酸化、胞质磷酸化及核内磷酸化结合DNA启动下游转录三种状态，但其磷酸化调控及磷酸化后由胞质向核转位的机制仍需深入探究。同时，UFMylation系统尤其是关键蛋白DDRGK1（亦称UFBP1）在软骨细胞分化与代谢中具有作用，DDRGK1突变会导致SOX9泛素化降解增加，同家族UFSP2突变亦会引起软骨发育异常，但DDRGK1在退变软骨中的功能及其与IL?6等炎症介质的关系尚不明确。此前研究发现DDRGK1通过UFMylation调节IRE1α稳定性影响软骨细胞内质网应激，但其在软骨退变中的潜在作用尚未被探讨。因此，研究人员提出假设：DDRGK1介导的UFMylation是STAT3通路的关键负调控因子，其功能丧失可能促进OA进展，并围绕该假设开展研究，最终证实DDRGK1通过UFMylation修饰STAT3抑制其磷酸化与核转位，维持软骨稳态，且STAT3磷酸化抑制剂可挽救由Ddrgk1缺失引起的软骨退变，为OA治疗提供了新型机制与潜在策略，该论文发表在《Journal of Advanced Research》。

为开展研究，研究人员主要使用以下关键技术方法：收集上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理批准的终末期OA患者膝关节置换术人软骨样本；构建Ddrgk1^fl/fl小鼠并与Col2a1?Cre?ERT及Aggrecan?Cre?ERT小鼠交配获得软骨特异性条件敲除小鼠，构建Ddrgk1 K268R点突变小鼠，建立内侧半月板失稳（DMM）手术模型；采用micro?CT（μ?CT）评估骨微结构；进行软骨组织切片Safranin?O?Fast Green染色及免疫荧光染色并评分；利用公共数据库GSE172500、GSE220243、GSE255460进行单细胞数据分析；通过CRISPR?Cas9系统构建Ddrgk1敲除与K268R突变细胞系，培养原代软骨细胞并进行平面高密度培养；开展RNA?seq、蛋白质组学、磷酸化蛋白芯片与磷酸化蛋白质组学检测；实施蛋白质印迹（WB）、Co?IP、蛋白交联联合质谱、胞质与核蛋白分离、荧光素酶报告实验、细胞免疫荧光及CatWalk XT步态分析；选用STAT3磷酸化特异性抑制剂SH?4–54进行体内外干预。

研究结果如下。

DDRGK1?UFMylation系统功能障碍促进OA发生发展：研究人员发现人胫骨平台软骨厚度随退变逐渐降低，DDRGK1表达尤其在深层区呈递减趋势，与OARSI评分呈负相关；人软骨细胞传代模拟体外退变中DDRGK1、SOX9、COL2下降而MMP13上升，人与小鼠单细胞数据均显示OA中UFMylation系统下调且在软骨细胞中主要表达并于膝损伤后急剧降低。软骨特异性Ddrgk1 cKo小鼠及Ddrgk1 K268R小鼠经DMM术后，μ?CT显示软骨下骨BV/TV显著降低、骨小梁丢失，Safranin?O?Fast Green染色显示软骨退变表型加重，OARSI、Mankin及OARSI System评分显著升高，免疫荧光证实软骨层Ddrgk1敲除伴随Col2a1与Aggrecan下调，表明DDRGK1?UFMylation系统功能受损会促进OA进展。

DDRGK1?UFMylation系统抑制蛋白磷酸化尤其是STAT3磷酸化：对K268R小鼠软骨蛋白质谱GO分析显示信号转导机制富集、蛋白激酶信号与激酶活性上调，RNA?seq GO显示对IL?6等细胞因子响应及STAT家族蛋白结合调节；Ddrgk1敲除ATDC5与软骨细胞RNA?seq显示细胞因子?受体互作与Jak?Stat信号通路显著改变，网络图与KDA图提示Il?6与Stat3为核心基因。磷酸化蛋白芯片证实cKo软骨细胞中STAT3与STAT4磷酸化上调而其他Jak?STAT成员无变化；HEK?293?T中IL?6处理上调328个蛋白磷酸化而DDRGK1过表达将其降至268个，交集42个蛋白中STAT3排第8。WB显示IL?6刺激下野生型软骨细胞p?STAT3(Y705)与p?STAT3(S727)上调且DDRGK1下降，cKo组磷酸化上调更显著且该升高不能被内质网应激抑制剂ISRIB消除；ATDC5与HEK?293?T中亦呈相同趋势，DDRGK1过表达显著下调p?STAT3，表明DDRGK1?UFMylation系统选择性抑制STAT3磷酸化且与内质网应激途径无关。

DDRGK1通过K267?K531促进STAT3的UFMylation：纯化蛋白结合WB显示DDRGK1?Fc可与HA?STAT3相互作用；BS3交联联合质谱鉴定出DDRGK1 K116?STAT3 K163与DDRGK1 K267?STAT3 K531两对交联肽段，后者质谱二级碎裂信号更强。位点突变验证中DDRGK1 RGKFI_265–269突变为AAAAA（mut2）及STAT3 K163R（mut3）、K531R（mut4）均削弱相互结合，而SGKIG_114–118突变为AAAAA（mut1）不影响结合，证实DDRGK1 K267?STAT3 K531为主要相互作用位点；体内Co?IP显示DDRGK1 K268R突变显著减弱与STAT3相互作用。过表达UFMylation组分（UFM1、UFC1、UFL1、DDRGK1）可诱导STAT3与UFM1结合，而DDRGK1 K267R或STAT3 K531R削弱该结合，表明DDRGK1?K267介导对STAT3?K531的UFMylation修饰。

更高亲和力的UFM1与磷酸化STAT3结合抑制STAT3磷酸化与核转位：Co?IP显示野生型ATDC5中DDRGK1与STAT3、p?STAT3(Y705)、p?STAT3(S727)结合，而Ddrgk1 K268R突变体中结合亲和力显著降低。HEK?293?T中STAT3磷酸化模拟突变体Y705D（mut5）与S727D（mut6）与DDRGK1及UFMylation系统结合率更高。DDRGK1过表达不改变胞质p?STAT3(Y705)但显著下调核内p?STAT3(Y705)；Ddrgk1敲除或K268R的ATDC5中胞质与核内p?STAT3(Y705)均上调，IL?6刺激进一步增强；免疫荧光显示K268R组p?STAT3(Y705)增加且核转位显著增多，荧光素酶报告显示DDRGK1过表达减弱IL?6刺激的STAT3转录活性，表明UFMylation通过空间占位效应阻碍STAT3磷酸化二聚化及核转位。

Ddrgk1?K268在OA发展中调控STAT3磷酸化与核转位：人软骨免疫荧光显示DDRGK1随退变在深层区显著下调，STAT3总量无显著差异，未损伤软骨深层区胞质中DDRGK1与STAT3共定位且STAT3核定位少，退变加重后共定位减少而STAT3与DAPI共定位（核转位）持续增加并与OARSI评分呈正相关线性回归。K268R与cKo小鼠软骨中p?STAT3(Y705)与p?STAT3(S727)表达及核转位均显著增加；人软骨细胞多代传代模型与小鼠原代软骨细胞传代中DDRGK1逐渐下降而p?STAT3(Y705)上调，Ddrgk1敲除进一步上调p?STAT3(Y705)，证实DDRGK1低表达与功能缺失会增强STAT3磷酸化与核转位。

STAT3特异性抑制剂SH?4–54挽救Ddrgk1敲除引起的OA：平面高密度培养显示IL?6诱导野生型与cKo原代软骨细胞及ATDC5退变，SH?4–54可挽救该表型；WB证实IL?6刺激下Ddrgk1敲除与K268R中p?STAT3(Y705)进一步上调，SH?4–54处理下调其表达且不显著影响p?STAT5(Y694)。体内DMM术后关节内注射SH?4–54，步态分析显示cKo小鼠右后肢Print Area、Mean Intensity与Swing Speed下降，SH?4–54处理后Print Area与Mean Intensity显著回升；组织学显示cKo软骨破坏最严重、评分最高，SH?4–54处理后各组成分下降且cKo降幅最显著；μ?CT显示cKo软骨下骨BV/TV降低、Tb.Sp增加，SH?4–54处理后BV/TV上调、Tb.Sp下调，表明抑制STAT3磷酸化可挽救Ddrgk1缺失导致的OA。

讨论部分总结：研究人员指出既往虽知DDRGK1参与软骨发育，但缺乏其与软骨退变及OA关联的证据，本研究首次证实人退变软骨尤其深层区DDRGK1显著下调，软骨特异性Ddrgk1 cKo加重膝关节退变，单细胞分析显示OA发生发展中UFMylation系统多数成员下调。已有研究报道DDRGK1不同区段分别结合CDK5RAP3、ASC1、IRE1α并介导UFMylation参与内质网应激与信号转录，而本研究揭示DDRGK1在软骨退变中调控蛋白磷酸化尤其是STAT3磷酸化，该机制较大程度独立于PERK介导的内质网应激信号。STAT3的磷酸化、二聚化与核转位是Jak/Stat信号及炎症响应关键事件，IL?6通过Jak/Stat促进OA，但DDRGK1与STAT3磷酸化的关系未见报道。本研究明确DDRGK1?K267与STAT3?K531相互作用并由DDRGK1?K267介导STAT3的UFMylation，产生空间占位效应阻碍STAT3磷酸化二聚化而非依赖继发性内质网应激；磷酸化模拟突变体Y705D与S727D与DDRGK1及UFM1亲和力更高，K267R突变削弱UFMylation并增加STAT3 Y705与S727磷酸化加重关节退变。SH?4–54挽救实验在体内验证该机制并为DDRGK1下降、STAT3磷酸化增加的老年OA患者提供潜在治疗策略。研究局限性在于人样本量较小、未在老年OA或其他动物模型验证、SH?4–54长期安全性未评估。

结论部分翻译：我们的研究为DDRGK1通过抑制STAT3磷酸化调控软骨退变的作用提供了关键见解。DDRGK1介导的STAT3 UFMylation抑制STAT3磷酸化与核转位。软骨中DDRGK1水平下降会损害DDRGK1?STAT3 UFMylation轴并促进OA进展。使用STAT3磷酸化抑制剂治疗可挽救OA，是针对DDRGK1表达降低所致软骨退变的一种有前景的治疗途径。因此，我们的研究通过靶向DDRGK1?STAT3 UFMylation轴，为OA治疗提供了新型机制与潜在策略。