《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Encapsulation of Hemin Chloride and Doxorubicin in Two-Compartment Polycaprolactone Micro- and Nanoparticles for Sequential Redox Priming and Enhanced Lung Cancer Treatment
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摘要我们开发了一种基于双室聚(ε-己内酯)（PCL）的递送系统，该系统结合了低强度氧化还原预处理与核周边多柔比星（DOX）递送，以此增强肺癌细胞内的抗肿瘤作用。氯化血红素被封装在水动力直径约为2微米的PCL微粒中，通过血红素介导的活性氧生成，引发适度且持续的细胞内氧化应激。与此同
摘要
我们开发了一种基于双室聚(ε-己内酯)（PCL）的递送系统，该系统结合了低强度氧化还原预处理与核周边多柔比星（DOX）递送，以此增强肺癌细胞内的抗肿瘤作用。氯化血红素被封装在水动力直径约为2微米的PCL微粒中，通过血红素介导的活性氧生成，引发适度且持续的细胞内氧化应激。与此同时，多柔比星被封装在水动力直径约为450纳米的PCL纳米粒中，以便快速被细胞摄取、聚集在细胞核周围，进而进入细胞核内。这些递送载体是通过油水乳化-溶剂蒸发法制备的，从而实现了大小范围明确且可控、形态稳定以及药物载量可重复的特点。在所有测试条件下，空的PCL微粒和纳米粒在A549人类肺腺癌细胞以及NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞中均表现出良好的细胞相容性。在A549细胞中，PCL-血红素能促使细胞内活性氧水平呈时间依赖性上升，48小时时其水平约为对照组的45倍，且在测试条件下并未造成明显的细胞毒性。而PCL-多柔比星则能实现逐步的细胞摄取，首先在细胞核周围积累，随后进入细胞核。与单独使用任一药物或同时使用两种药物相比，先使用PCL-血红素进行预处理，再使用PCL-多柔比星处理的序贯治疗方式，能显著提升细胞毒性、细胞凋亡率以及DNA损伤信号强度。此外，相同剂量下，这种序贯治疗方式的抗肿瘤效果也优于游离多柔比星。这些研究结果表明，利用可调控的PCL平台实现时空协调的药物递送，不仅能提高细胞内的抗肿瘤效果，还能降低达到治疗效果所需的整体药物剂量。
引言
肺癌仍是全球范围内癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌占绝大多数病例[1]。尽管针对EGFR和ALK等可靶向的致癌驱动因子的抑制剂以及免疫检查点疗法，已为部分具有特定分子或免疫特征的患者延长了生存期，但仍有大量患者因缺乏可靶向的突变、出现获得性耐药、发生免疫相关不良反应，或不适合接受强效全身性治疗，不得不继续依靠传统的细胞毒性化疗[2, 3]。然而，治疗的有效性受到肿瘤内药物分布不均的限制，这会导致有效的药物暴露不足；同时，外排转运蛋白的活性会降低细胞内及细胞核内的药物浓度；此外，DNA损伤反应及促存活信号通路的快速激活也会削弱治疗的效果[4, 5, 6, 7, 8]。系统性毒性，尤其是累积性的心脏毒性和骨髓毒性，限制了剂量的增加；而肿瘤微环境中的异常血管结构、缺氧状况以及适应性氧化还原缓冲机制，也为治疗带来了更多障碍[9, 10, 11]。因此，亟需开发能够通过肿瘤相关机制增强细胞内细胞毒性效应的递送策略，而非仅仅依赖增加药物剂量[12]。
在各类传统细胞毒性药物中，多柔比星是一种有助于研究如何在不单纯提高剂量的情况下增强药物在细胞内的作用的理想模型。多柔比星的细胞毒性主要源于其与DNA的结合以及对拓扑异构酶II的抑制，这两者都会引发复制压力和双链断裂，进而导致细胞凋亡[13, 14]。尽管多柔比星具有明确的抗癌功效，但其临床应用却受到诸多限制：累积性的心脏毒性决定了其临床使用的最大累计剂量上限；外排转运蛋白会降低细胞核周边区域的药物浓度；同时，DNA损伤反应及ATM/ATR、NF-κB等促存活信号通路的快速激活，也能减轻早期的基因毒性损伤[8, 15]。此外，肿瘤细胞中改变的氧化还原环境也会进一步加剧耐药性，因为升高的抗氧化缓冲能力可以部分抵消活性氧所引发的细胞毒性信号传导[9, 10]。综上所述，简单的剂量递增是一种风险高、收益低的策略，因此人们开始关注对细胞内药物作用的时空调控，尤其是那些能在细胞毒性作用之前调整肿瘤氧化还原状态的方案[16]。
基于这一思路，在使用多柔比星之前进行氧化还原预处理，有望降低化疗引起的细胞毒性的阈值。氯化血红素，又称铁原卟啉IX氯化物，是一种具有氧化还原活性的铁卟啉化合物。在低至中等浓度下，它能够适度且可控地升高细胞内的活性氧水平，从而打破肿瘤细胞中异常的氧化还原平衡，降低谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等抗氧化系统的缓冲能力[17, 18]。除了直接的促氧化作用外，还有研究表明，血红素还能通过活性氧破坏线粒体膜电位并激活细胞内的凋亡途径，从而降低细胞的凋亡阈值，使癌细胞对细胞毒性药物更敏感[19]。不过，血红素对血红素加氧酶-1的激活作用具有情境依赖性：适度的、短暂的HO-1激活可能伴随轻度的氧化预处理，并起到调节作用；而过度或长期的HO-1活化则可能促进细胞的保护性适应，降低细胞凋亡的可能性，进而导致多种癌症类型的化疗耐药性[20, 21, 22]。因此，有效的氧化还原预处理需要将活性氧的水平控制在足以削弱抗氧化防御、使细胞对后续细胞毒性作用更敏感的范围之内，同时避免引发强烈的HO-1介导的保护性适应。在本研究中，并未直接检测HO-1的表达情况，因此关于其可能的作用，仅参考了现有文献，而非本研究直接证实的机制[23, 24]。
为了将这种氧化还原预处理理念转化为可控的递送形式，就需要一种能够同时实现持续释放血红素以及分阶段释放多柔比星的合适载体平台。聚(ε-己内酯)是一种半结晶性、生物相容性好且可生物降解的聚合物，它具有良好的物理化学稳定性、缓释特性以及加工灵活性，因此可用于制备具有可调控药物释放行为的微粒和纳米级载体[25, 26]。与PLGA和PLA这类降解速度更快的聚酯相比，PCL的水解速率较慢，因此其长期药物释放曲线更为可预测，非常适合用于实施缓释预处理策略[27]。与两种药物同时释放、可能阻碍顺序性生物学作用的传统共包封系统，或是需要复杂制造工艺的Janus型或核壳型单粒子双室结构不同，本研究采用的两种不同尺寸的载体策略，利用细胞对不同尺寸颗粒的差异性摄取和释放特性，实现了氧化还原预处理与细胞毒性药物递送之间的时间分隔[28]。我们认为，将低强度的氧化还原预处理与核周边多柔比星递送相结合，能够增强细胞内的细胞毒性作用，同时也为降低药物剂量提供可能的基础[29, 30, 31]。据此，我们设计了一种双室PCL颗粒系统：其中载有血红素的PCL微粒（水动力直径约为2微米，这一尺寸非常适合通过吸入方式在肺部沉积），能够实现适度且持续的预处理效果；而载有多柔比星的PCL纳米粒则能促进药物快速被细胞摄取，并更快地使其到达细胞核周边区域[32, 33, 34]。我们选择乳化法来制备这些载体，是因为该方法既适用于疏水的PCL材料，也适用于两亲性的药物分子，同时还能通过调节剪切力、表面活性剂浓度以及各相的比例，精确控制微粒和纳米粒的尺寸[35, 36, 37, 38]。
本研究假设，载有血红素的PCL微粒所引发的低强度氧化还原预处理，能够暂时降低细胞的抗氧化缓冲能力，从而使肿瘤细胞对PCL纳米粒所递送的核周边多柔比星更加敏感[39]。我们将研究这两种制剂的物理化学性质（尺寸分布、形态、载药量、包封效率），测定与pH值相关的药物释放动力学，以细胞内活性氧水平的升高作为氧化还原预处理程度的替代指标，观察多柔比星纳米粒在细胞内的摄取情况及其在细胞核周边的定位情况，最后比较序贯处理与同时处理与游离多柔比星处理相比，在细胞毒性、细胞凋亡以及DNA损伤标志物方面的差异[17, 40, 41]。
章节要点
材料与方法
聚己内酯（PCL，分子量约14,000克/摩尔）、聚乙烯醇（PVA，分子量146,000-186,000，纯度≥99%）、血红素（来自牛源，纯度≥90%，编号H9039，购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司）、盐酸多柔比星以及2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）均购自Sigma-Aldrich公司。二甲基亚砜（DMSO，纯度99.8%）购自Sigma-Aldrich公司，氯仿（CHCl?，纯度99.8%）购自德国达姆施塔特的Merck公司。高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基
空白PCL颗粒与载药PCL颗粒的拉曼光谱分析
空白PCL微粒和纳米粒呈现出PCL特有的化学特征谱峰，而载有血红素和多柔比星的颗粒则出现了与相应药物成分相关的额外光谱特征（见图1a–f）。在空白PCL微粒中（见图1a），在大约2919厘米?1、1720厘米?1和1080厘米?1处出现了显著的拉曼峰，分别对应于C–H键伸缩振动、酯基C=O键伸缩振动以及C–O–C键伸缩振动。空白PCL纳米粒则显示出
结论
我们成功开发了一种基于双室PCL的药物递送系统，该系统包含载有血红素的微粒以及载有多柔比星的纳米粒，可用于协同实现肺癌细胞中的氧化还原预处理与细胞毒性药物递送。物理化学性质分析表明，这两种制剂都具有尺寸可控、形态稳定以及药物载量可重复的特点。拉曼光谱分析证实了血红素和多柔比星已成功被整合到相应的PCL载体中，而扫描电子显微镜成像则进一步
CRediT作者贡献说明
陈振华：论文撰写——初稿撰写、正式分析、数据整理。 蔡熙智：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资源提供、正式分析。 黄春江：软件使用、资源提供。 吴宗云：研究指导、实验开展、数据整理。 高辰宇：结果验证、研究指导、资源提供、方法设计、正式分析、数据整理、概念构建。 吴祖渊：研究指导、资源提供、资金获取
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
陈振华|吴宗云|黄春江|吴祖渊|高辰宇|蔡熙智
