《Macromolecular Bioscience》：In Vivo Evaluation of Conductive Biopolymer-Based 3D Bioprinted Nerve Conduit in Sciatic Nerve Injury Repair
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周围神经损伤（Peripheral nerve injury, PNI）是由创伤和意外事故引起的最常见病症之一。成功的周围神经再生可能受益于使用具备充足物理、机械和生化信号的导管来重构天然神经微环境。研究人员报道了一种利用藻酸盐/甲基纤维素/还原氧化石墨烯（A
周围神经损伤（Peripheral nerve injury, PNI）是由创伤和意外事故引起的最常见病症之一。成功的周围神经再生可能受益于使用具备充足物理、机械和生化信号的导管来重构天然神经微环境。研究人员报道了一种利用藻酸盐/甲基纤维素/还原氧化石墨烯（Alginate/methylcellulose/reduced graphene oxide, Alg/MC/rGO）水凝胶制备的电导性3D生物打印神经导管。rGO的掺入赋予了水凝胶改善的电导率，同时通过氯化钙双重交联保持了良好的可打印性和形状保真度。研究人员对rGO进行了彻底表征以确认其理化特性。优化的Alg/MC/rGO水凝胶表现出挤出式生物打印所需的剪切稀化行为，并成功打印了3D结构（网格和神经导管）。Alg/MC/rGO支架的理化分析证实了支架内存在rGO。在分析电导率特性时，观察到Alg/MC/rGO支架显示出的电导率值（～7.5 × 10?2 S/m）处于周围神经的生理范围内。MTT和活/死细胞（Live/dead） assay等体外测定证实，支架显示的细胞相容性高于ISO标准中提到的阈值。使用Sprague Dawley大鼠的坐骨神经横断（5 mm）模型进行的体内评价显示，植入后21天，Alg/MC/rGO神经导管显著提高了坐骨功能指数（Sciatic functional index）值。组织学分析进一步证实再生神经中神经纤维排列良好、髓鞘再形成以及胶原百分比降低。总体而言，这些发现确立了对Alg/MC水凝胶内掺入rGO并结合双重交联策略为神经导管提供了结构和导电信号，从而加速了神经修复，为下一代神经引导导管（Nerve guide conduit, NGC）提供了一个有前景的平台。
该研究发表于《Macromolecular Bioscience》。目前周围神经损伤（Peripheral nerve injury, PNI）全球每年影响百万人，导致感觉运动障碍与残疾。现有金标准自体神经移植（Autografts）存在供体稀缺、几何尺寸不匹配、供区畸形及神经瘤风险等局限；传统神经引导导管（Nerve guide conduit, NGC）难以同时兼顾仿生结构、力学支撑与生理电传导信号模拟。鉴于此，研究人员开展了一项将还原氧化石墨烯（Reduced graphene oxide, rGO）引入藻酸盐/甲基纤维素（Alginate/methylcellulose, Alg/MC）体系，结合挤出式3D生物打印与双重交联策略构建导电神经导管的研究，旨在在体内外验证其理化性能、细胞相容性及在Sprague Dawley大鼠5 mm坐骨神经缺损模型中促进神经再生与功能恢复的效果。研究结论表明，该Alg/MC/rGO导管电导率处于生理范围，显著提升术后21天坐骨功能指数（Sciatic functional index, SFI），组织学证实纤维排列规整、髓鞘再生良好且胶原沉积减少，为下一代NGC提供了可行平台。
为开展本研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：对商用rGO进行扫描电镜（Scanning electron microscopy, SEM）、动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）、紫外可见光谱、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared, FTIR）及X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）表征；制备Alg/MC/rGO水凝胶并采用挤出式Cellink Inkredible+生物打印机优化打印网格与10 mm长神经导管，实施氯化钙预交联与后交联的双重交联（Dual crosslinking）；利用流变仪分析剪切稀化与模量，通过SEM、溶胀、降解、FTIR及阻抗分析仪评估支架理化与电学性能；以大鼠施万细胞（Rat Schwann cell, RSC96）进行MTT与活/死细胞（Live/dead） assay细胞相容性测试；建立Sprague Dawley大鼠5 mm坐骨神经横断缺损模型，设对照组、损伤组与Alg/MC/rGO导管组，术后14天与21天通过步态分析计算SFI，21天取材行苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin, H&E）、Luxol快蓝与Masson三色染色组织学评估。
研究结果如下：
3 Results and Discussion。研究人员首先对rGO进行表征，SEM显示褶皱层叠形貌，DLS平均流体动力学半径约200 nm，Zeta电位?40.57 mV表明胶体稳定，UV–Vis在～217 nm处有C═C的π–π*跃迁峰，FTIR显示C─H、C═O、C═C、C─O等特征峰，XRD在23.18°与43.5°出现特征峰，d间距0.38 nm，符合rGO典型结构。随后研究人员优化Alg/MC/rGO水凝胶，流变学显示二者均具剪切稀化，Alg/MC/rGO在低剪切速率粘度>250 000 mPa s，随剪切速率升高降至～50 000 mPa s，存储模量（Storage modulus, G′）与损耗模量（Loss modulus, G″）在40–50 rad/s发生交叉，由类液体转为类固体行为，打印结构形状保真度优于单纯Alg/MC；SEM证实打印网格孔隙均匀、导管内壁连续，表面嵌有片状rGO。FTIR显示掺入rGO后峰强减弱。溶胀实验表明Alg/MC/rGO 48小时溶胀率221.97% ± 14.73%，低于Alg/MC的557.38% ± 36.21%，降解实验45天内Alg/MC/rGO重量损失约25%，低于Alg/MC的～50%，显示rGO增强交联与结构稳定性。电导率测试显示Alg/MC/rGO为7.5 × 10?2 ± 1.4 × 10?2 S/m，处于人周围神经生理范围（8.0 × 10?2 至 1.3 S/m），而Alg/MC仅7.6 × 10?5 ± 6.5 × 10?5 S/m。细胞实验中间接MTT显示第5、7、14天细胞活性超ISO 10993–5阈值70%，第1天略降至～65%；活/死染色全程以活细胞（绿色荧光）为主，RSC96呈正常梭形铺展，证实支架具持续细胞相容性。体内实验中，术后14天损伤组与导管组SFI相近（?57.3 ± 3.6 vs ?55.6 ± 4.1），术后21天导管组SFI显著提升至?37.9 ± 2.4，优于损伤组?66.2 ± 6.5（p < 0.01）。H&E定量显示导管组染色面积48.7% ± 8.9%，低于损伤组119.2% ± 28.7%，接近原生神经64.1% ± 12.7%，结构更规整；Luxol快蓝染色示导管组髓鞘部分恢复；Masson三色显示导管组胶原35.0% ± 1.8%，显著低于损伤组55.2% ± 3.4%（p < 0.001），接近原生27.1% ± 5.2%，纤维化减轻。
讨论部分总结指出，本研究首次报道了Alg/MC体系中掺入rGO并结合双重交联的挤出式3D生物打印神经导管，解决了单纯Alg/MC绝缘与结构保真不足的问题。rGO作为纳米填料提升电导率至生理范围，并通过氢键与离子交联增强网络稳定性，降低溶胀与降解速率。体内数据显示导电 cues 加速轴突再生与髓鞘化，抑制胶原过度沉积与瘢痕形成，SFI改善显著。但研究仍存在局限：仅为21天短期评价与小缺损模型，缺乏长期随访、进阶对照组、直接神经突分析及力学表征，未来需在更大缺损、更长周期、详细毒理及加入生物活性信号方向推进以迈向临床转化。
结论部分翻译如下：本研究展示了利用挤出式生物打印技术制备基于Alg/MC/rGO水凝胶的3D生物打印神经导管并进行评价。研究人员对rGO进行了彻底表征以了解其性质。优化的水凝胶表现出挤出式生物打印所需的剪切稀化行为。研究人员设计了一种使用氯化钙的独特双重交联策略以获得良好的可打印性和形状保真度。理化分析证实rGO在Alg/MC共混物内均匀分布，支架电导率处于周围神经生理范围内。体外细胞相容性测定验证了Alg/MC/rGO支架支持RSC96细胞活力高于ISO定义的细胞相容性阈值。此外，在Sprague Dawley大鼠5 mm坐骨神经横断模型中体内植入显示，植入后21天坐骨功能指数改善，功能恢复明显。组织学评价证实纤维化减少、髓鞘化更好以及再生神经纤维排列良好。总体而言，研究人员得出结论，3D生物打印Alg/MC/rGO神经导管结合双重交联策略作为先进的3D生物打印神经导管平台，在周围神经再生中显示出巨大前景。
