《Advanced Science》：Phosphorylation-Facilitated CKB Lactylation At K11 By GCN5 Enhances Creatine Kinase Activity and Mitigates Neuronal Damage After Cerebral Ischemia-Reperfusion
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卒中中的缺血再灌注（I/R）损伤可通过氧化应激和代谢功能障碍导致严重的神经元损伤。除代谢作用外，乳酸还可诱导赖氨酸乳酰化，但其对神经保护的影响仍不明确。研究人员在小鼠I/R模型中采用整合蛋白质组学、乳酰化组学和磷酸化组学分析，鉴定出肌酸激酶B型（CKB）是K1
卒中中的缺血再灌注（I/R）损伤可通过氧化应激和代谢功能障碍导致严重的神经元损伤。除代谢作用外，乳酸还可诱导赖氨酸乳酰化，但其对神经保护的影响仍不明确。研究人员在小鼠I/R模型中采用整合蛋白质组学、乳酰化组学和磷酸化组学分析，鉴定出肌酸激酶B型（CKB）是K11乳酰化和S199磷酸化的双重靶标。研究发现，这些修饰可增强CKB酶活性，促进磷酸肌酸代谢，抑制活性氧（ROS）并在缺血条件下支持神经元存活。从机制上看，乙酰转移酶GCN5催化K11乳酰化，而Sirt5作为去乳酰化酶发挥作用。值得注意的是，S199磷酸化通过促进GCN5募集而促进K11乳酰化，提示这两种修饰之间存在层级性相互作用。体内研究证实，K11乳酰化或S199磷酸化任一环节受损，均会削弱CKB功能、加重神经元损伤，并延迟卒中后的功能恢复。这些发现揭示了一种协同的翻译后修饰机制，该机制能够增强CKB活性并在脑I/R损伤中赋予神经保护作用，为卒中干预提供了潜在治疗靶点。
这篇发表于《Advanced Science》的研究围绕脑缺血再灌注损伤中的代谢应激适应机制展开，核心问题是：卒中再灌注虽然恢复了脑血流，却同时引发氧化应激、线粒体功能障碍、钙超载、脂质过氧化和炎症级联，最终导致高能量需求而储备有限的神经元出现严重损伤。当前卒中治疗的关键难点不仅在于复流本身，更在于如何在再灌注过程中维持神经元代谢稳态与能量缓冲能力。近年来，乳酸已不再被视为单纯的糖酵解终产物，而是兼具能量底物与信号分子的双重属性；尤其是赖氨酸乳酰化（lysine lactylation）作为新型翻译后修饰，已被证实参与染色质调控、转录调控和胞质蛋白功能调节。然而，在脑缺血再灌注背景下，究竟哪些乳酰化事件具有直接功能意义，尤其是否作用于维持神经元能量稳态的关键代谢酶，仍缺乏系统阐明。
研究人员因此聚焦肌酸激酶B型（CKB），这是一种在脑内高表达的能量代谢酶，参与肌酸-磷酸肌酸（PCr）穿梭系统，通过利用PCr将ADP快速再磷酸化为ATP，从而在急性能量压力下稳定细胞内能量供给。研究人员提出，缺血期间乳酸堆积可能并非仅造成损伤，也可能通过乳酰化修饰内源性调控CKB，形成适应性神经保护反应。基于这一假设，研究构建了小鼠大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型和体外氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型，系统鉴定了CKB在缺血应激中同时发生K11乳酰化与S199磷酸化，并证明这两种修饰协同提高CKB活性，增强磷酸肌酸代谢，抑制氧化应激，减轻神经元凋亡，最终改善脑缺血再灌注后的组织损伤与行为学恢复。论文的核心意义在于揭示了乳酸信号并非简单取决于浓度高低，而取决于其是否被整合进特异性翻译后修饰网络；同时提出CKB是连接乳酸代谢、蛋白修饰与神经保护的重要代谢节点。
本研究主要采用以下关键技术方法：研究人员在雄性C57BL/6小鼠MCAO/R模型与Neuro-2a细胞、原代皮层神经元OGD/R模型中开展研究；通过无标记蛋白质组学、乳酰化组学和磷酸化组学联合筛查差异修饰靶标；采用免疫沉淀（IP）、Western blot、位点突变、AAV介导的神经元表达、酶活检测、肌酸与ATP定量、Seahorse线粒体呼吸分析、TMRE膜电位检测、ROS/MDA检测、TTC染色、Nissl染色及行为学评估进行功能验证；并结合分子对接分析S199磷酸化对GCN5-CKB相互作用及K11乳酰化构象基础的影响。
2.1 Lactate Accumulation and Global Protein Lactylation are Elevated in Ischemic Models In Vivo and In Vitro
研究人员首先验证缺血再灌注是否伴随乳酸堆积与全局蛋白乳酰化升高。通过TTC染色确认MCAO/R模型建立成功后，发现小鼠缺血侧皮层及OGD/R处理的原代神经元中乳酸含量显著升高。进一步通过Pan-Kla免疫印迹与免疫荧光证实，MCAO/R后缺血侧皮层多个时间点的全局蛋白乳酰化明显增强，且神经元（MAP2阳性）、星形胶质细胞（GFAP阳性）和小胶质细胞（Iba1阳性）均出现Pan-Kla上调。外源乳酸钠处理可剂量依赖性提高Neuro-2a细胞乳酰化水平而不影响细胞活力。该部分说明，脑I/R应激可诱导乳酸积累并驱动蛋白乳酰化升高，为后续寻找功能性乳酰化靶点奠定基础。
2.2 Global Proteome, Lactylome, and Phosphoproteome Profiling Reveal Post-Translational Reprogramming in Ischemic Cortex
为描绘脑I/R后的翻译后修饰图谱，研究人员对sham与MCAO/R皮层进行整合蛋白质组、乳酰化组和磷酸化组分析。结果显示，蛋白表达谱、乳酰化位点和磷酸化位点均发生广泛重编程，其中乳酰化差异位点128个，磷酸化差异位点827个。差异修饰蛋白主要定位于细胞核与细胞质，并在能量代谢和细胞应激相关功能中富集。Venn分析提示CKB同时携带K11乳酰化和S199磷酸化，成为两类修饰的汇聚节点。基于CKB在ATP再生中的关键作用，研究人员据此将其确定为后续重点分析对象。
2.3 CKB K11 Lactylation Enhances Creatine Kinase Activity and Confers Neuroprotection Against OGD/R-Induced Injury
乳酰化组学显示，MCAO/R后CKB K11位点乳酰化显著升高。研究人员构建Flag-CKB野生型与K11R去乳酰化缺陷突变体，在Neuro-2a细胞中比较其功能。结果表明，K11R显著削弱CKB乳酰化信号，并丧失对OGD/R细胞毒性的保护作用。与野生型相比，K11R不能提高CK活性，也不能有效降低细胞内肌酸水平，提示其促进磷酸肌酸合成的能力受损。此外，野生型CKB可明显抑制ROS积累，而K11R失去该抗氧化作用。在线粒体功能方面，野生型CKB提高备用呼吸容量，部分缓解线粒体膜去极化；K11R则基本不能维持这一适应性代谢储备。AAV介导的原代神经元实验得到一致结果：K11乳酰化有助于提高CK活性、促进肌酸利用、增强线粒体呼吸弹性并维持膜电位。该部分证明，CKB K11乳酰化是缺血应激下增强CKB酶活和神经元耐受性的关键机制。
2.4 CKB S199 Phosphorylation Enhances its Creatine Kinase Activity and Protects Against OGD/R-Induced Injury
磷酸化组学分析显示，CKB的S164和S199位点在MCAO/R后磷酸化上调。功能突变研究进一步表明，真正具有明确保护意义的是S199而非S164。S199A突变显著降低p-CKB S199水平，并削弱CKB对OGD/R细胞损伤的保护作用。与野生型相比，S199A不能有效提升CK活性、降低细胞内肌酸含量，也不能抑制ROS累积。在线粒体功能上，S199A同样丧失了提高备用呼吸容量和稳定线粒体膜电位的能力。原代神经元AAV实验再次验证，S199磷酸化是维持缺血条件下CKB代谢功能和线粒体稳态的重要位点。相比之下，S164A或S164D对细胞活力、酶活、肌酸代谢、ROS、MDA及CKB乳酰化均无显著影响，因此后续机制分析聚焦S199。该部分说明，CKB S199磷酸化与K11乳酰化一样，是增强酶活和细胞保护的重要修饰。
2.5 GCN5 is the Acyltransferase for CKB K11 lactylation, and Sirt5 Functions as its Delactylase
在明确K11乳酰化具有功能意义后，研究人员进一步寻找其上游调控酶。通过候选乙酰转移酶筛选发现，GCN5与PCAF都可与CKB发生相互作用，但只有GCN5过表达能显著增强CKB乳酰化水平，因此确定GCN5为介导CKB K11乳酰化的关键酰基转移酶。GCN5过表达能够增强细胞活力、提升CK活性并降低肌酸含量；而GCN5抑制剂MB-3则降低OGD/R诱导的CKB乳酰化，抑制CK活性并恢复肌酸水平。上述结论在MCAO/R小鼠脑组织中得到验证：MB-3预处理降低内源性CKB K11乳酰化，减弱CK活性并提高肌酸含量。另一方面，去乳酰化酶筛选显示Sirt5可直接与CKB结合并降低其乳酰化水平；Sirt5过表达能抵消CKB介导的细胞活力增益，并在OGD/R条件下抑制CK活性。由此，研究建立了“GCN5-CKB-Sirt5”动态调控轴，解释K11乳酰化的可逆调控机制。
2.6 CKB S199 Phosphorylation Promotes GCN5-Mediated K11 Lactylation and Enhances Cytoprotection
在发现K11乳酰化与S199磷酸化均能增强CKB功能后，研究人员进一步分析二者之间的层级关系。结果显示，K11R突变不影响S199磷酸化，而S199A突变则伴随CKB乳酰化下降，说明K11乳酰化依赖S199磷酸化。进一步构建磷酸模拟突变体S199D后发现，该突变在对照和OGD/R条件下均可增强CKB乳酰化水平。机制上，S199D显著增强CKB与GCN5结合，而S199A削弱二者相互作用；在与GCN5共转染条件下，S199D进一步提高CK活性、降低肌酸、提高细胞活力，并更有效抑制ROS与MDA，而S199A则损害这些效应。分子对接结果显示，S199磷酸化有助于维持CKB-GCN5复合物更稳定的界面接触，降低结合自由能，并缩短乳酰供体与K11关键原子之间的平均距离，从而为GCN5介导的K11乳酰化提供更有利构象基础。相反，S199磷酸化并不影响Sirt5与CKB的结合，提示其主要选择性促进GCN5依赖的乳酰化过程。该部分揭示了一种层级性翻译后修饰串扰：S199磷酸化先行，促进GCN5募集，进而增强K11乳酰化。
2.7 Dual Post-Translational Modifications of CKB K11 lactylation and S199 Phosphorylation Jointly Confer Neuroprotection Against Cerebral I/R injury in Mice
在体内层面，研究人员通过尾静脉注射AAV，在神经元中特异表达野生型CKB或K11R、S199A突变体，并在3周后实施MCAO/R。结果证实，MCAO/R可诱导脑内CKB K11乳酰化和S199磷酸化，而相应突变能有效阻断目标位点修饰。功能上，与表达野生型CKB的小鼠相比，K11R和S199A组皮层CK活性下降、肌酸水平升高，提示CKB酶活受损。氧化应激指标MDA在野生型CKB组降低，但在两类突变体中保护作用部分丧失。凋亡方面，野生型CKB降低Active-Caspase-3表达及阳性细胞数，而突变组改善较弱。Nissl染色显示，野生型CKB可更好保留神经元形态和尼氏体结构，突变组仅部分保留。说明K11乳酰化和S199磷酸化共同决定了CKB在脑I/R中的完整神经保护效应。
2.8 CKB K11 Lactylation and S199 Phosphorylation Synergistically Preserve Brain Integrity and Promote Long-Term Functional Recovery Following Cerebral I/R Injury in Mice
研究人员进一步评估这些修饰对长期结局的影响。TTC染色表明，野生型CKB显著减小梗死体积，而K11R和S199A均削弱这一作用。MCAO/R后4周Nissl染色显示，野生型CKB组神经元保存和皮层结构恢复最明显，突变组仅见部分改善。行为学方面，平衡木、梯格行走和转棒实验显示，表达野生型CKB的小鼠在4周观察期内运动协调和平衡能力恢复更佳；K11R和S199A组恢复幅度有限。该部分证明，K11乳酰化与S199磷酸化不仅参与急性期神经保护，也对长期脑结构保全和运动功能恢复至关重要。
讨论部分总结
本文通过多组学联合分析和多层次功能验证，系统揭示了脑缺血再灌注过程中CKB受双重翻译后修饰协同调控的新机制。研究的关键贡献在于：第一，明确了乳酸在脑I/R中的作用具有情境依赖性，不能仅以其积累水平判断利弊，更应关注其是否被纳入适应性翻译后修饰通路；第二，鉴定出CKB K11乳酰化是脑I/R中新发现的功能性修饰，可增强酶活、改善线粒体呼吸储备并减少神经元凋亡；第三，提供了CKB S199磷酸化在该场景下促进酶活和神经保护的证据；第四，揭示S199磷酸化通过增强GCN5募集而促进K11乳酰化，形成具有层级性的修饰串扰网络。研究同时指出局限性，包括体外实验主要依赖外源过表达策略、体内样本量相对有限、S199促进K11乳酰化的精细结构机制尚待冷冻电镜（cryo-EM）和核磁共振（NMR）等手段进一步解析，以及人组织和临床相关模型中的可转化性仍需验证。总体而言，该研究将乳酸代谢、翻译后修饰和神经元能量稳态三者有机联系起来，为卒中神经保护提供了新的代谢信号轴和潜在治疗靶点。
研究结论部分翻译
总之，本研究阐明了一种双重修饰机制：K11乳酰化与S199磷酸化协同调控脑缺血再灌注中的CKB活性及神经保护作用。这些翻译后修饰之间的相互作用揭示了酶学调控的新层面，对神经元代谢和损伤修复具有广泛意义。上述发现为靶向翻译后修饰串扰的神经保护策略开辟了新方向，并加深了对代谢信号如何通过精确蛋白修饰转导为功能结局的理解。
