《Advanced Science》：Cysteine Redox State Governs the Condensation Pathway of Hendra Virus W Protein and Differentially Impacts Type I IFN and NF-κB Signaling
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亨德拉和尼帕病毒是属于副粘病毒科的人畜共患生物安全4级病原体。研究人员之前表明，它们的W蛋白是逃避宿主抗病毒反应的关键参与者，能够在体外形成高度灵活的弯曲原纤维。在此，研究人员表明，半胱氨酸氧化状态作为分子开关，控制着无定形聚集体或灵活原纤维的形成，并且第2至
亨德拉和尼帕病毒是属于副粘病毒科的人畜共患生物安全4级病原体。研究人员之前表明，它们的W蛋白是逃避宿主抗病毒反应的关键参与者，能够在体外形成高度灵活的弯曲原纤维。在此，研究人员表明，半胱氨酸氧化状态作为分子开关，控制着无定形聚集体或灵活原纤维的形成，并且第2至29位残基对原纤维化至关重要。研究人员还发现，HeV W蛋白（WHeV）也可以在细胞内自组装。WHeV形成不同类型的核凝聚物，这些凝聚物对半胱氨酸氧化还原状态表现出不同的依赖性。虽然缺失第2-29位残基会阻止核丝的形成，但半胱氨酸替换为丝氨酸主要损害非丝状凝聚物的形成。感染和WHeV异位表达均触发氧化应激，这可能有利于WHeV凝聚。最后，研究人员表明，受损的形成氧化还原敏感的非丝状凝聚物的能力与W抑制NF-κB途径的能力降低相关，反之，它通过增强W与STAT1的结合而增强了W抑制干扰素反应途径的能力。
亨德拉病毒和尼帕病毒属于单股反链病毒目副粘病毒科，是高死亡率的人畜共患病原体，被世界卫生组织列为优先目标。由于缺乏可用的抗病毒药物或疫苗，且病毒被归类为生物安全4级（BSL-4）病原体，针对这两种病毒发病机制的研究至关重要。副粘病毒通过共转录编辑机制合成V和W蛋白，这些病毒毒力因子是抑制宿主抗病毒反应的关键。W蛋白具有核定位序列（NLS）并在感染细胞核内积累，不仅能够结合并将STAT1和STAT2隔离在细胞核内从而抑制干扰素（IFN）反应，还能通过其C末端结构域（CTD）结合14-3-3蛋白从而抑制NF-κB诱导的促炎反应。然而，W蛋白如何从抑制IFN反应切换至抑制NF-κB介导的反应，其具体机制尚不明确。研究人员此前发现W蛋白具有内在无序特性且能在体外形成高度灵活的弯曲原纤维，且其含有的半胱氨酸残基参与了W蛋白的二聚化。据此，为了阐明半胱氨酸残基在W蛋白聚集及功能转换中的作用，研究人员开展了此项研究。研究结果表明，WHeV在细胞内能够自组装，并通过对NF-κB和IFN-I途径的差异性调节帮助病毒实现免疫逃逸。该研究为理解W蛋白在不同聚集状态下的功能多样性及其在病毒发病机制中的角色提供了新的分子线索，具有重要的科学意义。该论文发表在《Advanced Science》。
在关键技术与样本队列方面，研究人员主要使用了体积排阻色谱（SEC）分析蛋白质的寡聚化状态，使用负染电子显微镜（NS-EM）观察原纤维形态，利用圆二色谱（CD）光谱分析蛋白质二级结构的转变，并通过生物膜干涉技术（BLI）测定蛋白质分子间的结合动力学。定点诱变技术被用于构建各种半胱氨酸突变的蛋白质变体。在细胞实验中，使用了HEK293T细胞、BEAS-2B细胞以及A549细胞系进行转染研究。此外，在免疫途径分析中，使用了稳定表达受NF-κB启动子或ISRE控制的荧光素酶报告基因的细胞系。
半胱氨酸负责寡聚体的形成及紧密构象的产生
通过SEC分析WHeV和WNiV蛋白在氧化预孵育过程中的状态，研究人员发现这些蛋白质能够快速形成二聚体及更高阶的寡聚体。质谱分析揭示了一种具有紧密构象的单体形式，这是由分子内二硫键的形成引起的。当加入还原剂二硫苏糖醇（DTT）时，这些寡聚体和紧密构象消失，表明它们的形成具有氧化还原敏感性，依赖于分子间和分子内的二硫键。
半胱氨酸氧化是WHeV和WNiV原纤维化所必需的
通过浊度和硫黄素T（ThT）荧光测量发现，未经氧化预孵育的蛋白质仅形成无定形聚集体，不结合ThT；而经过氧化预孵育后，蛋白质能够形成结合ThT的原纤维。NS-EM观察证实了无定形聚集体与原纤维之间的形态差异。CD光谱表明原纤维中β折叠含量增加。这些结果表明，二硫键的形成是W蛋白原纤维化的初始步骤。通过将所有半胱氨酸替换为丝氨酸的变体（CallS）证实，突变体仅保持单体状态并产生无定形聚集体，无法形成原纤维。
WHeV原纤维结构的形成在还原后不可逆
为了评估原纤维化是否可逆，研究人员在蛋白质形成原纤维后加入DTT。结果显示，虽然溶解度和ThT结合力下降，但原纤维并未解聚，而是形成了巨大的纤维状结构簇。这表明，一旦原纤维形成，就由氧化还原非依赖性机制维持稳定，还原仅导致这些纤维结构的无序聚集。
二聚体足以启动原纤维化
通过构建仅保留单个半胱氨酸的三重突变变体，研究人员证实，这些能够形成二聚体的变体均能成功形成原纤维。此外，通过构建化学诱导二聚化的融合蛋白FKBP-CallS，在加入AP20187分子后成功诱导了二聚化并促进了原纤维化。这说明WHeV的二聚化是驱动成核过程并形成原纤维的关键步骤。
WHeV的第2至29位氨基酸区域对原纤维化是绝对必需的
进一步研究表明，去除WHeV前29个残基的变体即使在氧化条件下也无法形成原纤维。这证实，尽管氧化的半胱氨酸是必需的，但它们对于原纤维化并不充分，第2至29位氨基酸区域是WHeV原纤维化严格所需的。
WHeV在转染细胞核中形成不同类型的凝聚物
利用四胱氨酸标签在活细胞内可视化WHeV，研究发现WHeV在细胞核内能自组装形成巨大的丝状结构，以及球状斑点、短杆状和不规则聚集体等多种非丝状凝聚物。三维重建分析显示，核内仅存在一根具有分支的丝状结构，占据约5%的细胞核体积。球状凝聚物呈现固体性质，不具有液态融合特征。这些凝聚物的形成并不引发细胞焦亡或死亡，而是轻微降低细胞代谢活性。
去除前29个氨基酸消除丝状结构形成，而半胱氨酸至丝氨酸替换损害其他类型凝聚物的形成
在细胞内，Δ29变体无法形成丝状结构，这与体外实验结果一致。而CallS变体虽在一定程度上保留了形成丝状结构的能力，但完全丧失了形成斑点状凝聚物的能力，且不规则聚集体也显著减少。这表明非丝状凝聚物的形成依赖于由二硫键介导的二聚体或寡聚体。
W蛋白表达和HeV感染均诱导活性氧（ROS）的产生
由于病毒感染常伴随ROS的产生，研究检测了WHeV表达对氧化应激的影响。结果显示，野生型WHeV的表达显著诱导了ROS产生，而CallS变体未引起ROS增加。HeV感染同样证实了ROS水平的上升。这表明非丝状凝聚物的形成可能创造了有利于二硫键形成和蛋白质凝聚的氧化环境。
CallS变体削弱WHeV对NF-κB途径的抑制但增强对IFN信号的抑制
在研究凝聚物的功能影响时，研究人员发现野生型WHeV能够有效抑制NF-κB途径活性，而CallS变体由于无法形成非丝状凝聚物，其抑制NF-κB途径的能力显著减弱。相反，CallS变体对IFN-I途径的抑制能力较野生型更强。无法形成丝状结构的Δ29变体的功能则不受影响。这说明WHeV对NF-κB途径的抑制与其形成二硫键介导凝聚物的能力相关，而其单体形式在抑制IFN-I反应中更为高效。
STAT1强烈结合W单体但不结合原纤维
通过共聚焦显微镜观察W蛋白变体与STAT1在细胞内的定位，发现所有变体都能将STAT1重定位至细胞核。为进一步探究结合特异性，研究人员利用BLI技术进行体外结合测定。结果显示，STAT1能够强烈结合单体形式的WHeV，却不与原纤维结合。这直接表明，STAT1的结合位点在原纤维中被掩蔽，从而为CallS变体增强抑制IFN-I途径提供了机制解释。
讨论部分表明，研究人员阐述了半胱氨酸残基在W蛋白体外原纤维化过程中的关键作用，并揭示了二聚体作为成核驱动因素的重要性。在细胞内，WHeV能通过引发ROS产生而创造局部的氧化环境，从而促进依赖二硫键的凝聚物形成。在感染初期，W蛋白大量表达并迅速形成凝聚物，有助于病毒快速对抗宿主的先天免疫反应。研究结论指出，WHeV介导的NF-κB途径抑制与依赖氧化还原的非丝状凝聚物的形成密切相关，而W蛋白单体形式的隔离使其能够更有效地捕获STAT1并阻断IFN-I信号传导。病毒通过精巧调控W蛋白在单体与寡聚凝聚物状态之间的转换，实现了同时抑制不同先天免疫途径的目的。该研究不仅为副粘病毒W蛋白的致病机制提供了深刻洞见，也拓宽了对病毒功能性生物凝聚物作为宿主免疫逃逸策略的科学理解。
