益生菌衍生囊泡通过热凝胶共聚物直肠递送促进溃疡性结肠炎的黏膜愈合和减轻炎症

《Advanced Science》：Probiotic-Derived Vesicles Rectally Delivered via Thermo-Gelling Copolymer Promote Mucosal Healing and Reduce Inflammation in Ulcerative Colitis

　　

溃疡性结肠炎因其需要局部控制炎症、恢复黏膜完整性以及避免全身毒性而仍然难以治疗。在此，研究人员报告了一种直肠给药、可喷雾、热响应性透明质酸基共聚物平台，用于局部共递送益生菌衍生胞外囊泡（Probiotic-derived extracellular vesicles, ProEVs）和5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid, 5-ASA）。该系统能够增强治疗药物在炎症结肠部位的滞留和持续呈递。与单独治疗相比，联合制剂展现出更好的治疗效果，促进黏膜恢复和肠道稳态。机制上，该平台调节炎症反应、支持上皮屏障功能并有助于微生物群再平衡。值得注意的是，与活益生菌相比，胞外囊泡提供了一种更有效且一致的治疗模式。重要的是，该制剂专为临床转化而设计，具有局部给药、低毒性以及冻干后稳定性，可实现即取即用。这些发现强调了将胞外囊泡与基于生物材料的递送系统整合作为炎症性肠病多功能治疗策略的潜力。

**研究背景与问题**：溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一种慢性、复发性胃肠道疾病，其治疗面临局部控制炎症、恢复黏膜完整性并避免全身毒性的挑战。现有疗法（如氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫调节剂、生物制剂及JAK抑制剂）虽能控制急性炎症，但常伴随严重不良反应（如肝毒性、感染、恶性肿瘤），且无法充分解决上皮屏障功能障碍和微生物失调等关键致病因素。益生菌虽能调节肠道菌群、增强屏障功能，但受限于活菌存活率低、定植不一致及宿主反应差异。益生菌衍生的胞外囊泡（Probiotic-derived extracellular vesicles, ProEVs）作为无细胞替代品，保留了功能特性且稳定性更高，但其在胃肠道内快速清除、滞留不足的问题亟待解决。为此，研究人员开展了一项研究，旨在开发一种基于生物材料的局部递送平台，以同时实现免疫调节、屏障修复和微生物群调控。

**研究内容与结论**：研究人员开发了一种热响应性透明质酸基共聚物平台（PNHA），用于直肠局部共递送来自多菌株益生菌VSL#3的ProEVs和5-氨基水杨酸（5-ASA）。通过在TNBS诱导的结肠炎大鼠模型中进行评估，结果表明该联合制剂（PNHA-5ASA-ProEVs）在减轻炎症、恢复上皮屏障完整性和重塑肠道菌群方面显著优于单独治疗及传统口服或直肠VSL#3益生菌。该平台有效抑制了炎症介质（如TNF-α、粪便钙卫蛋白），促进了屏障和再生标志物（如ZO-1、MUC2）的表达，并诱导巨噬细胞向抗炎M2表型极化。多组学分析揭示了ProEVs在转录组和蛋白质组层面重编程宿主向组织修复、免疫消退和微生物稳态转变的广泛效应。该研究首次展示了生物材料包裹、直肠递送的益生菌衍生囊泡疗法同时针对UC病理的三大核心支柱（免疫失调、上皮损伤、微生物失衡）。该无细胞局部递送策略相比活益生菌具有更高的安全性、稳定性和转化可行性，且制剂可冻干保存，支持即取即用。

**论文发表在《Advanced Science》**。

**主要关键技术方法**：研究人员主要采用了以下关键方法：（1）合成PNHA共聚物：通过自由基聚合合成P(NIPAM-co-NTBAM)-NH₂，再与透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）经EDC/NHS偶联得到PNHA，并表征其低临界溶解温度（LCST）和流变学性质。（2）ProEVs分离与表征：在厌氧条件下培养VSL#3多菌株，通过超滤和超速离心提取ProEVs，利用透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、原子力显微镜（AFM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）表征其形态、粒径和表面电荷。（3）体内外功能评估：在HT-29细胞和RAW 264.7巨噬细胞中评估抗氧化、细胞增殖和免疫调节能力。（4）动物模型：使用TNBS诱导的Wistar大鼠结肠炎模型（样本来源：CSIR-Central Drug Research Institute），分为六组进行直肠给药治疗，监测疾病活动指数（DAI）、体重、结肠长度、组织学（H&E和Alcian蓝-PAS染色）及血清/粪便标志物。（5）微生物群分析：通过16S rRNA测序分析粪便微生物群组成和多样性。（6）多组学分析：包括ProEVs的蛋白质组学（LC-MS/MS）和结肠组织的转录组学（RNA-seq）。

**研究结果（保留各小节标题）**：

**2.1 PNHA-ProEVs制剂的开发与理化表征**：研究人员合成了PNHA共聚物，其LCST约34°C，在生理温度下迅速溶胶-凝胶转变，并表现出对结肠组织的强粘附性（72小时保留率57.9%）。ProEVs呈球形，直径约90–120 nm，表面电荷约-30至-50 mV。ProEVs封装后不改变PNHA的热响应性，流变学证实了凝胶行为。

**2.2 ProEVs的稳定性、蛋白质组学表征与功能评估**：ProEVs从PNHA基质中在24小时内以近零级动力学释放（94%），释放后形态完整。释放的ProEVs被HT-29细胞有效摄取，且蛋白质和脂质含量与新鲜ProEVs相当。PNHA-ProEVs具有抗氧化活性（DPPH和H₂O₂清除实验），促进HT-29细胞增殖，并在TNBS诱导的炎症应激下显著提高细胞活力。蛋白质组学显示ProEVs富含蛋白质合成、细菌存活、黏膜愈合和免疫调节相关蛋白，主要来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳杆菌（L. helveticus）、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。

**2.3 PNHA-ProEVs制剂减轻氧化应激并促进抗炎巨噬细胞极化**：在H₂O₂诱导的氧化应激模型中，PNHA-ProEVs处理显著提高HT-29细胞活力，降低细胞内ROS水平。在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中，PNHA-ProEVs抑制NO释放、下调iNOS和IL-6表达，上调IL-10表达，并促进M2（CD163⁺）表型极化，同时减少M1（CD86⁺）细胞比例。

**2.4 PNHA-ProEVs制剂通过调节肠道菌群和恢复肠道稳态发挥结肠炎治疗疗效**：在TNBS大鼠模型中，PNHA-5ASA-ProEVs组（Group 6）在DAI评分、体重恢复、结肠长度保留、组织学修复（减少炎症浸润、恢复隐窝结构）方面表现最佳。该组显著降低了肠道通透性（FITC-右旋糖酐实验）。微生物群分析显示，该组α多样性最高，富集了有益菌科（Akkermansiaceae、Lactobacillaceae、Clostridiaceae），并恢复了健康样微生物组成。

**2.5 PNHA-ProEVs调节黏膜标志物和细胞因子的表达**：PNHA-ProEVs治疗组显著降低了血清TNF-α和钙卫蛋白水平。在结肠组织中，上调了ZO-1、MUC2、IL-10、TGF-β的表达，下调了IL-6和TNF-α。免疫荧光染色证实了ZO-1和CD163表达增加，iNOS表达减少。

**2.6 PNHA-ProEVs直肠制剂在恢复肠道屏障完整性和微生物群方面优于口服和直肠益生菌**：与口服或直肠VSL#3相比，PNHA-ProEVs组在体重、DAI、结肠长度、组织学（H&E和Alcian蓝-PAS染色）方面均显著改善。微生物群分析显示，PNHA-ProEVs组OTU数量和α多样性最高，且更接近健康对照，富集了双歧杆菌科、链球菌科、乳杆菌科等有益菌。

**2.7 PNHA-ProEVs制剂在减轻炎症和恢复上皮屏障方面优于口服和直肠VSL#3**：PNHA-ProEVs组血清TNF-α和粪便钙卫蛋白水平显著降低，结肠组织ZO-1和MUC2 mRNA表达上调，IL-6下调，IL-10上调。免疫荧光显示ZO-1和CD163表达增强，iNOS和VEGF表达减少。

**2.8 转录组学洞察揭示ProEVs疗效的免疫调节和再生机制**：PNHA-ProEVs治疗诱导了结肠转录组的显著重编程，包括抑制炎症相关基因（如TNF、Nos2、Ccl2）和激活上皮修复、代谢及氧化磷酸化通路。与健康组织相比，治疗后转录组差异极小，提示其恢复了稳态。

**2.9 PNHA的长期体内生物相容性评估**：PNHA植入大鼠背部肌肉袋两周后，未观察到行为异常、体重变化或血清生化指标（尿素、白蛋白、胆红素、肌酐、SGOT、SGPT、甘油三酯）异常。主要器官（肝、肺、肾、心、脾、胸腺、结肠）组织学未见炎症或坏死，证明其良好的生物相容性。

**2.10 PNHA-ProEVs的即取即用治疗潜力确保临床准备**：冻干后的PNHA-ProEVs（含海藻糖）在4°C储存6个月后，仍保持LCST、释放动力学、ProEVs形态、粒径、蛋白质/脂质含量及抗氧化活性（DPPH、细胞内ROS清除、细胞保护）不变，支持其作为即用型产品。

**总结讨论**：本研究提出了一种结合益生菌衍生胞外囊泡（ProEVs）与热响应性PNHA共聚物基质的新型无细胞治疗策略，用于局限性、内镜引导下的直肠递送治疗炎症性肠病（IBD）。该智能生物材料系统在结肠炎小鼠模型中，在减轻炎症、恢复上皮屏障完整性和再平衡肠道菌群方面显著优于传统口服和直肠VSL#3制剂。该混合平台有效抑制了TNF-α和粪便钙卫蛋白等炎症介质，同时促进了关键屏障和再生标志物的表达，并促使巨噬细胞向抗炎M2表型再极化。多组学分析强调了ProEVs在重编程宿主转录组和蛋白质组向组织修复、免疫消退和微生物稳态方面的广谱影响。研究结论翻译如下：本研究首次展示了生物材料封装、直肠递送的益生菌衍生囊泡疗法，同时针对IBD病理的三大关键支柱——免疫失调、上皮损伤和微生物失衡。与活益生菌相比，这种无细胞、局部递送方法提供了更高的安全性、稳定性和转化可行性。尽管本研究仅限于急性结肠炎的临床前模型，但未来在慢性及复发模型中的研究对于评估长期疗效、应答持久性以及向临床验证的推进至关重要。总之，研究人员的发现为下一代多功能、临床适应性强的IBD疗法奠定了基础，为智能生物材料和基于微生物组的干预措施开辟了新途径。