基于胆绿素的基因编码近红外荧光蛋白探针，可用于在生物系统中对与损伤相关的磷脂酰丝氨酸进行光学成像

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Genetically encoded near-infrared fluorescent protein probes based on biliverdin enable optical imaging of injury-associated phosphatidylserine in biological systems

　　

摘要

由于传统荧光探针往往受到组织自荧光、光穿透深度有限以及染料与蛋白质标记不均匀性的限制，对与损伤相关的膜变化的光学成像仍然具有挑战性。在此，我们报道了两种基于胆绿素的基因编码近红外荧光蛋白探针，可用于检测磷脂酰丝氨酸的暴露情况，而磷脂酰丝氨酸是一种与损伤引发的膜结构变化相关的保守膜信号。这些探针是通过将红色荧光蛋白（miRFP670nano3）与小型磷脂酰丝氨酸靶向蛋白（乳粘素C2结构域或凋亡素V）融合而制成的，分别命名为LMB和AMB。这种单多肽设计具有明确的分子结构、近红外荧光特性，以及磷脂酰丝氨酸识别功能与光学报告基因之间的固定关联。光谱分析显示，该蛋白的吸收峰和发射峰分别位于645纳米和675纳米处，脂质膜实验则表明其能优先结合磷脂酰丝氨酸。在化学损伤的细胞中，这两种探针都能以剂量依赖的方式检测到磷脂酰丝氨酸的暴露，其中AMB在贴壁细胞成像中产生的信号更强，而LMB通过流式细胞术可标记更多悬浮细胞中的磷脂酰丝氨酸。在体外皮肤移植模型中，LMB和AMB产生的信号分别比非靶向对照组高2.3倍和2.7倍。在小鼠皮肤伤口中，局部应用这两种探针可使信号强度提升18.6倍和22.2倍。在颈部深层肌肉损伤的体内模型中，系统性给予这两种探针后，其产生的信号分别比对照探针高2.6倍和4.5倍，且随着组织修复，目标信号会逐渐减弱。这些结果表明，近红外荧光蛋白探针可作为光化学定义的光学工具，用于复杂生物系统中与损伤相关的磷脂酰丝氨酸暴露的相对定量及纵向监测。

引言

组织损伤涉及多种动态分子事件，包括膜结构变化、细胞死亡、炎症反应、血管响应以及基质重塑[1]。光学成像非常适合用于观察这些过程，因为它具有高灵敏度、良好的空间分辨率，并且适合进行纵向观测[2]、[3]。然而，在复杂组织中，早期与损伤相关的信号往往具有短暂性、不均匀性，还可能被组织自荧光、光散射以及非特异性探针结合所掩盖。磷脂酰丝氨酸是一种阴离子型氨基磷脂，通常存在于细胞膜的内侧叶，而它向外侧叶的转移则是细胞凋亡、坏死、机械损伤、氧化应激、血管损伤以及与炎症相关的膜结构变化所共有的特征[4]、[5]、[6]。因此，对磷脂酰丝氨酸暴露情况的光学成像可为研究损伤相关的膜结构变化及组织修复提供分子层面的信息。

传统的磷脂酰丝氨酸靶向探针，尤其是荧光标记的凋亡素V，已被用于检测凋亡细胞[7]、[8]、[9]。不过，基于蛋白质的探针往往依赖于化学染料偶联，这种方式可能导致标记位点不均匀、染料与蛋白质的比例不稳定，而且不同批次之间也存在差异。此外，许多可见光波段的荧光蛋白由于组织自荧光、光衰减以及信噪比低的问题，在组织成像中的应用也受到限制[3]、[10]。这些局限性使得不同实验之间的定量比较变得复杂，也降低了在复杂生物组织中检测磷脂酰丝氨酸的可靠性。

为此，我们开发了近红外荧光探针，以提高在生物组织中的光学检测能力。我们采用了最近报道的一种能够与胆绿素结合的近红外荧光蛋白——miRFP670nano3，该蛋白源自蓝细菌中的GAF结构域[11]。这是一种单体蛋白，分子量约为17千道尔顿，属于目前最小的基因编码近红外探针之一，具有优异的光物理性质，包括较高的量子产率（0.185）以及670纳米处的明亮发射峰[11]。由于其体积小且为真正的单体结构，因此可以灵活地在N端或C端进行融合，也可以在宿主蛋白内部进行标记，而不会引发聚集现象。由于哺乳动物组织中天然存在胆绿素，miRFP670nano3能够实现高对比度的活体成像[11]。不过，末端融合并不总是不会影响蛋白功能。有研究显示，将蛋白与白蛋白进行N端或C端融合时，可能会因结构域呈现方式的不同而降低靶标蛋白的活性或降低产品的均一性[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。例如，将一种抗降解的胰高血糖素样肽-1类似物与人类血清白蛋白进行N端融合后，其受体结合活性相比游离肽降低了100多倍[16]。

我们将这种单体蛋白与小型磷脂酰丝氨酸靶向蛋白（乳粘素C2结构域或凋亡素V）进行基因融合，从而得到了两种探针，分别命名为LMB和AMB。我们证明了这两种探针具有出色的光学性能、对磷脂酰丝氨酸的高选择性、良好的细胞标记能力、体外深层组织成像能力、体内伤口成像能力，以及初步的生物相容性。因此，我们的研究为长期光学监测与损伤相关的磷脂酰丝氨酸暴露提供了结构明确的蛋白探针。

内容片段

材料与试剂

编码小鼠凋亡素V、大鼠乳粘素以及miRFP670nano3的质粒是由中国苏州的GeneWiz公司合成的。除特别说明外，其他生化试剂均购自中国上海的国药集团化学试剂有限公司或美国新英格兰生物实验室。所有溶液都是使用分析级试剂和无菌去核酶水配制的。

细胞培养与实验动物

人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠成纤维细胞（L929）均购自美国马里兰州罗克维尔的ATCC公司。这些细胞

基因编码探针前体的构建、表达与纯化

为了构建结构明确的磷脂酰丝氨酸靶向荧光蛋白探针，我们以miRFP670nano3作为光学支架，通过一个灵活的（GGGGS）3连接子将其与乳粘素C2结构域或凋亡素V融合起来（见图1a）。我们共制备了三种探针前体：仅含miRFP670nano3的探针（M）、乳粘素C2结构域与miRFP670nano3融合的探针（LM），以及凋亡素V与miRFP670nano3融合的探针（AM）。探针M作为非靶向荧光蛋白对照，而LM和AM则代表了两种不同的磷脂酰丝氨酸识别形式

讨论

此前，磷脂酰丝氨酸主要作为生物标志物被用于基于凋亡素V的成像研究[18]。已有临床研究使用放射性标记的凋亡素V对各种癌症患者进行检测，结果始终表明该探针能够检测出化疗或放疗过程中由治疗诱发的细胞凋亡，且成像信号与治疗反应之间存在显著相关性[19]、[20]、[21]、[22]。例如，放射性标记的凋亡素V显像技术已成功揭示出早期的细胞凋亡现象

结论

总之，我们成功开发了LMB和AMB这两种基于胆绿素的基因编码近红外荧光蛋白探针，可用于检测与损伤相关的磷脂酰丝氨酸暴露情况。这两种探针都具有明确的蛋白结构、近红外光学检测能力，且无需通过化学染料偶联即可实现對磷脂酰丝氨酸的选择性结合。它们能够在化学损伤和机械损伤的细胞中检测到磷脂酰丝氨酸的暴露，在体外皮肤组织中产生目标相关的信号，可实现皮肤伤口的强效局部成像，同时还适用于系统性给药后的检测

CRediT作者贡献说明

胡静：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化分析，验证，方法学设计，实验实施，正式分析，数据整理，概念构思。吴鲁生：验证，方法学设计，实验实施。陈雪英：方法学设计。李雷：方法学设计。王通耀：方法学设计。黄鹏：写作——审阅与编辑。徐鹏：监督，资源提供，资金获取。江龙光：监督，资源提供，资金获取。袁采：写作——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们的这项研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2023YFE0118400）以及中国国家自然科学基金（编号：32371312）的资助。

Jing Hu|Lusheng Wu|Xueying Chen|Lei Li|Tongyao Wang|Peng Huang|Peng Xu|Longguang Jiang|Cai Yuan|Mingdong Huang

福建师范大学化学学院，中国福建福州市350108