表面电荷工程屏蔽细胞外囊泡的血浆蛋白冠以实现系统性肝外靶向

《Materials Today Bio》：Surface Charge Engineering Shields Extracellular Vesicles from Plasma Protein Corona to Enable Systemic Extrahepatic Targeting

　　

血浆蛋白冠（PC）关键性地影响纳米药物的体内命运，但其组成及其对细胞外囊泡（EVs）的影响仍不明确。利用仿生循环系统，研究人员表征了两种临床相关EV类型——间充质基质细胞来源EV（MSC-EVs）和HEK293F来源EV（293F-EVs）——上的PC形成和调节。在动态流动下，两种EV类型均获得稳定的蛋白冠，导致粒径增大和表面电荷降低。蛋白质组学分析揭示了一个共享的蛋白冠特征，富含免疫球蛋白、补体和其他血浆成分。功能上，PC形成增强了巨噬细胞摄取并触发了炎症激活，主要通过蛋白冠结合的免疫球蛋白或补体C3与其各自受体之间的相互作用。为了阻断这一过程，研究人员开发了一种利用正电荷壳聚糖寡糖（COS）的电荷屏蔽策略来抑制PC组装。COS涂层有效地中和了EV表面电荷，并减少了调理素吸附和非特异性巨噬细胞清除，从而重塑了EV生物分布——限制了肝脏滞留并增强了向肝外器官的递送。在鼠脓毒症模型中，COS修饰的MSC-EVs进一步改善了肾脏和肺部结局，并显著提高了存活率。总之，这些发现阐明了EV相关血浆PC的分子结构和免疫学影响，并引入了一种有前景的抗冠策略，用于工程设计更隐蔽和更有效的EV基纳米治疗药物。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

细胞外囊泡（EVs）作为精准医学中的多功能平台，在无细胞治疗和靶向递送中展现出巨大潜力。然而，EVs系统给药后迅速暴露于血浆蛋白、循环免疫细胞和血流动力学力下，其清除、生物分布和治疗生物利用度受血浆蛋白冠（PC）的深刻影响。PC形成在合成纳米颗粒中已有充分表征，但在EVs上的组成和功能影响仍不明确。现有研究多采用静态孵育，无法模拟体内动态循环环境，且主要关注肿瘤或免疫细胞来源EVs，缺乏对临床可转化EVs（如MSC-EVs和293F-EVs）的PC分析。此外，PC驱动的单核吞噬细胞系统（MPS）清除，尤其是肝脏滞留，是纳米药物翻译的主要障碍，目前缺乏针对EVs的临床验证策略来减少MPS介导的清除并增强肝外分布。为此，研究人员建立了仿生循环系统，研究PC形成对EVs命运的影响，并开发了基于壳聚糖寡糖（COS）的表面电荷工程策略以抑制PC组装，从而改善EVs的治疗性能。该论文发表在《Materials Today Bio》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：1）建立仿生动态循环系统（数字蠕动泵，流速约40 cm/s模拟人腹主动脉血流），使EVs与来自健康供体的EV去除血浆（EVDP）在流动条件下相互作用；2）利用纳米颗粒追踪分析（NTA）测量粒径、浓度和zeta电位；3）通过直接数据非依赖采集质谱（direct-DIA MS）进行蛋白质组学分析，并交叉引用人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）和PRIDE数据库鉴定血浆来源蛋白；4）采用单分子超分辨率显微镜（dSTORM）验证蛋白冠成分与EV标记物的共定位；5）运用微尺度热泳（MST）测定COS修饰对蛋白结合亲和力的影响；6）在C57BL/6小鼠中建立盲肠结扎穿刺（CLP）诱导脓毒症模型，评估治疗疗效和生物分布。样本来源包括：人脐带MSCs来自东南大学附属中大医院（伦理批准），HEK293F细胞系购自Gibco，血浆从健康供体获得。

**研究结果**

**3.1 血浆蛋白冠在MSC-EVs和293F-EVs上的表征**
通过NTA、zeta电位、蛋白定量、银染和拉曼光谱分析，发现动态血浆暴露后，MSC-EVs和293F-EVs均形成稳定的PC，导致中位粒径分别增加约10 nm和18 nm，表面负电荷显著降低，蛋白含量分别增加约3.1倍和5倍，且蛋白图谱中出现与EVDP相似的新条带，拉曼光谱中蛋白特征峰（1257、2901、2940 cm^-1）增强。

**3.2 血浆蛋白冠谱分析**
通过直接DIA-MS蛋白质组学，鉴定出MSC-EVs和293F-EVs上分别有335和433个上调蛋白，其中血浆来源蛋白分别为208和263个。共享的82个蛋白包括免疫球蛋白（21%）、补体（9%）、脂蛋白（7%）、凝血相关蛋白（13%）、急性期蛋白（7%）和渗漏蛋白（6%）。Western blot和单分子超分辨率成像验证了IGHG1、C3、APOA1、FGA、A2M等代表蛋白在PC形成后显著富集并分布于EV周围。

**3.3 血浆蛋白冠形成触发巨噬细胞摄取和免疫反应**
GO富集分析显示共享蛋白显著富集于补体激活和体液免疫应答。PC形成对肝细胞和内皮细胞炎症影响微弱，但显著上调巨噬细胞中促炎因子（IL-6、TNF-α、CCL2、CCL5）mRNA水平，降低IL-10，增加IL-6和TNF-α分泌，并促进M1型极化。流式细胞术显示PC涂层EVs的巨噬细胞摄取增强，且该增强被补体C3受体（C3R）抑制剂和Fc受体阻断抗体显著抑制，提示免疫球蛋白和补体C3介导的受体依赖性吞噬。

**3.4 壳聚糖寡糖修饰保护MSC-EVs和293F-EVs免受血浆蛋白冠**
通过优化COS浓度（75 μg/mL），发现COS修饰有效中和EV表面负电荷，使PC诱导的zeta电位变化从约15-19 mV降至<1 mV。NTA显示COS修饰显著抑制PC导致的粒径增大，增加小颗粒（<200 nm）比例。BCA蛋白定量和Western blot证实COS修饰显著减少总蛋白以及IGHG1、C3、APOA1、FGA、A2M等代表蛋白的吸附。纳米流式细胞术显示COS修饰降低这些蛋白的阳性率和平均荧光强度。MST定量显示COS修饰使IGHG1和C3与293F-EVs的结合解离常数分别从2.588 μM升至21.854 μM，从0.64 μM升至16.338 μM，表明结合亲和力降低。

**3.5 壳聚糖寡糖修饰EVs逃避巨噬细胞清除并增强肝外生物利用度**
流式细胞术显示COS修饰显著降低PC诱导的巨噬细胞摄取，并抑制PC触发的促炎基因表达、细胞因子分泌和M1极化。在健康小鼠中，COS修饰减少MSC-EVs和293F-EVs在肝脏、肺和脾脏的积累。在CLP脓毒症小鼠模型中，COS修饰减少CD11b⁺单核细胞和肝脏巨噬细胞对EVs的摄取，降低肝脏滞留，同时增强MSC-EVs向肺、脑、心和肾的分布，以及293F-EVs向心和肾的分布。

**3.6 COS工程化MSC-EVs增强对脓毒症诱导肺肾损伤的保护**
在CLP脓毒症模型中，COS修饰的MSC-EVs将2天存活率从CLP组的40%提升至73.3%（未修饰MSC-EVs为53.3%）。血清生化指标显示，COS修饰的MSC-EVs显著降低肌酐（sCr）和急性肾损伤（AKI）发生率（降至10%），并更大幅度降低乳酸（LAC）、乳酸脱氢酶（LDH）、C反应蛋白（CRP）、IL-6和髓过氧化物酶（MPO）水平。组织学分析表明COS修饰的MSC-EVs更有效地减轻肺组织肺泡间隔增厚和炎症浸润，以及肾小管损伤和刷状缘丢失。肾损伤分子-1（Kim-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）mRNA表达进一步降低。免疫荧光显示COS修饰的MSC-EVs处理组肺和肾中巨噬细胞浸润（F4/80⁺）和焦亡标志物GSDMD表达均显著减少。体内安全性评估显示，持续14天注射COS修饰EVs后，小鼠体重、肝功能（ALT、AST）、肾功能（BUN、sCr）及主要器官组织学均无异常。

**总结与讨论**
本研究在仿生动态循环条件下，系统解析了MSC-EVs和293F-EVs的血浆蛋白冠组成，发现其富含免疫球蛋白和补体等调理素，促进巨噬细胞摄取和炎症激活，构成EV清除的主要障碍。研究人员开创了基于壳聚糖寡糖（COS）的表面电荷屏蔽策略，有效中和EV表面负电荷，抑制蛋白冠形成，减少MPS介导的肝脏滞留，并重定向EVs至肝外器官。在脓毒症模型中，COS修饰显著增强MSC-EVs对肺和肾的保护作用，提高生存率，且未观察到明显毒性。研究结论：本研究在仿生循环下解析了两种临床相关EV的血浆PC景观，揭示了其在驱动免疫清除中的关键作用。为了克服这一障碍，研究人员开创了基于COS的表面电荷调节策略，有效抑制PC形成，最小化MPS滞留，并重定向EVs用于系统性肝外递送。总之，这些发现确立了COS屏蔽工程作为一种生物相容且广泛适用的平台，用于优化EV基纳米药物的靶向能力和治疗潜力。