具有自切换活性的免疫调节纳米酶薄膜用于伤口感染治疗与愈合中的自适应感染-炎症-修复级联反应

《Materials Today Bio》：Immuno-modulatory nanozyme film with self-switchable activity for adaptive infection-inflammation-repair cascade in wound infection therapy and healing

　　

纳米酶（nanozymes）在伤口感染治疗与愈合中实现顺序的感染-炎症-修复的关键在于如何解决抗菌治疗与抗炎之间活性氧（reactive oxygen species, ROS）调控的矛盾。在此，研究人员首次设计并简易合成了一种由纳米线组成的独立原始CuGeO3（CGO）纳米酶薄膜（nanozyme film, NF）。这种具备柔性、湿组织粘附特性以及吸水/吸血能力的NF可作为伤口敷料，凭借其极其出色的光热性能，以及在酸性感染微环境（infection microenvironments, IMEs）中谷胱甘肽（glutathione, GSH）消耗增强的过氧化物酶（peroxidase, POD）样活性产生ROS，展现出优异的抗菌/抗生物膜功效，用于伤口感染的光热（photothermal therapy, PTT）/化学动力学（chemodynamic therapy, CDT）协同治疗。引人注目的是，研究发现在完成感染治疗后，随着IMEs转变为中性微环境，该CGO NF的酶活性会自动且持续地切换为过氧化氢酶（catalase, CAT）样活性以消除ROS。这促进了巨噬细胞向M2表型极化以缓解炎症并加速伤口修复。此外，CGO NF较长且缠绕的纳米线结构倾向于滞留在伤口部位，将其对健康组织的毒性降至最低。总体而言，这是首个利用仅由无机纳米材料组成的光热NF作为伤口敷料的范例。基于这种安全、有效、活性可切换的NF敷料，实现了伤口感染治疗与愈合中的自适应感染-炎症-修复级联反应，在10天内达到了98.7%的伤口闭合率。研究人员相信这项工作将推动活性可切换纳米酶的治疗应用，并为基于纳米酶的伤口感染治疗与愈合提供有意义的见解。

研究背景方面，当前通过纳米酶（nanozymes）催化活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成与消除以调节氧化还原稳态已成为伤口治疗的重要策略。然而，现有研究面临两大核心问题：一是纳米酶单独使用难以直接作为伤口敷料，负载于水凝胶或微针等载体易导致合成复杂、活性位点掩蔽及生物安全性风险；二是抗菌治疗需生成ROS而抗炎需消除ROS，二者在ROS调控上存在矛盾，且多数纳米酶无法随微环境动态切换活性以适应感染-炎症-修复的序贯过程。细菌感染微环境（infection microenvironments, IMEs）呈酸性（pH 4.5-6.5），细菌清除后转为中性，这一动态pH变化为设计环境响应型纳米酶提供了靶点。Cu基纳米酶具过氧化物酶（peroxidase, POD）样活性与光热性能，Ge衍生物具抗氧化/抗炎特性，但二者分别受限于生物安全性与功能单一性。因此，开发兼具敷料功能、高活性、自切换催化性及高生物安全性的无机纳米酶薄膜具有重要科学意义与临床价值。该研究发表于《Materials Today Bio》。

为开展研究，作者主要采用的关键技术方法包括：通过乙二胺辅助水热法结合真空抽滤工艺合成独立CuGeO₃（CGO）纳米酶薄膜（nanozyme film, NF）；利用扫描电镜（scanning electron microscopy, SEM）、透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）、高分辨透射电镜（high-resolution transmission electron microscopy, HRTEM）及X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）进行结构与形貌表征；借助紫外-可见-近红外漫反射光谱与密度泛函理论计算分析光学吸收与能带结构；通过光热稳定性测试、接触角测量评估敷料性能；利用比色法（TMB探针）、电子自旋共振（electron spin resonance, ESR）及溶氧监测评价pH激活的自切换酶活（POD样/CAT样）与谷胱甘肽（glutathione, GSH）消耗能力；采用CCK-8、溶血实验及小鼠皮下植入模型评估体外体内生物安全性与生物分布；通过平板计数、活死染色、SEM观察体外抗菌/抗生物膜效能；利用荧光探针、Western blot、流式细胞术及RNA测序分析细胞内ROS消除、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）表达、巨噬细胞M1/M2极化及相关免疫炎症通路；建立小鼠金黄色葡萄球菌感染全层皮肤缺损模型，在808 nm近红外（near-infrared, NIR）激光与H₂O₂协同下评估体内伤口感染治疗与愈合效果，并通过组织学（H&E、Masson、吉姆萨）与免疫荧光（TNF-α、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF））分析愈合质量。

研究结果部分保留小标题并简述如下：

2.1 Synthesis and characterization of CGO NF

研究人员通过200 ℃水热96 h及真空抽滤获得直径约40 mm、厚约0.2 mm的蓝色纸质独立CGO NF，具柔性与无损伤弯曲性。SEM与TEM显示其由直径22.3±5.9 nm、长2.3±0.7 μm的纳米线纠缠形成多孔网络（平均孔径14.6 nm）。HRTEM观测到0.29 nm与0.32 nm晶格间距对应正交CGO的(001)与(120)面，沿[001]方向生长，FFT证实单晶性质，STEM-EDS证实Cu、Ge、O均匀分布且Cu/Ge原子比约1:1，XRD匹配正交CGO（JCPDS 74-0302），证实成功合成CGO NF。

2.2 Optical absorption of CGO NF and theoretical calculations

紫外-可见-近红外漫反射光谱显示CGO NF在近红外区约712 nm处有高吸收峰（～1.7 eV），媲美金纳米棒局域表面等离子体共振。密度泛函理论计算表明CGO为半导体（带隙3.3 eV），价带顶由O和Cu构成、导带底由Cu构成，计算吸收峰约780 nm（～1.6 eV），与实验及既往理论吻合，该吸收源于d-d电子跃迁，支撑优异光热性能。

2.3 Photothermal performance of CGO NF

808 nm近红外激光照射下，CGO NF温度随功率密度（0.1-1 W/cm²）升高12.4-146.3 ℃，5 s内快速升温并达平台；60次开关循环最高温稳定于约70 ℃，具出色光热稳定性与快升快降特性以避免正常组织热损伤。猪皮（厚3.8 mm）覆盖下仍实现高效加热且无显著皮内升温，证明深层组织安全穿透潜力。

2.4 Water/blood absorbing capability and wet tissue adhesion properties of CGO NF

CGO NF具超亲水性，水滴接触角0.7 s内降至近0°，可快速吸水、吸血并对湿组织适度粘附（防二次损伤），满足敷料渗出液吸收与密封需求。

2.5 pH-activated CGO NF with self-switchable activity

CGO NF在酸性（pH 5.5-6.5）下具显著POD样活性（氧化TMB显蓝，ESR检出•OH，Km 45.97 mM，Vmax 4.33×10^-8 M s^-1）与GSH消耗能力（DTNB探针证实），808 nm激光热效应进一步增强POD活性；中性（pH 7.4）下POD活性消失而CAT样活性（分解H₂O₂产O₂）达最优，且随pH升高而增强。二者竞争源于HO₂•生成速率差异：酸性下•OH主导（POD），中性下HO₂•促O₂生成并消耗•OH（CAT）。模拟糖尿病环境仍保持pH依赖的自切换活性。GeO₂对照仅具GSH消耗而无显著双酶活性，表明CGO协同机制源于Cu²⁺/Cu⁺与Ge⁴⁺/Ge²⁺氧化还原及三元中间复合物形成。

2.6 Biosafety of CGO NF

体外CCK-8显示HaCaT、3T3、人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblast, HSF）在<640 ppm浓度下高存活；Transwell体系中间充质膜隔离下3T3存活率>75%（至1280 ppm）；溶血率<4%，具良好血液相容性。体内小鼠皮下植入30天，体重无显著变化，主要脏器Cu/Ge含量极低且随时间下降，H&E无炎症损伤，血液生化与血常规正常，长缠结纳米线滞留伤口限制全身暴露，证实优良体内外生物安全性（短期评估，长期待究）。

2.7 In vitro antibacterial activity of CGO NF

多孔结构利于细菌吸附。0.5 W/cm² NIR 10 min下CGO NF对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌存活率分别降至0.11%与0.1%；降为0.3 W/cm² 5 min时，CGO NF+H₂O₂+NIR组菌存活率仅约1%，显示PTT/CDT协同增效并降低热损伤风险。活死染色与SEM证实该协同严重破坏金黄色葡萄球菌生物膜（红荧光主导、结构崩解）。ROS荧光显示CGO NF+H₂O₂+NIR组最强，机制为多孔活性位点捕菌、PTT热破膜抑粘附、POD产•OH穿膜毁核酸蛋白、GSH耗竭与热协同促•OH生成。

2.8 Intracellular ROS elimination capability

中性下CGO NF具CAT样活性，H₂O₂诱导氧化应激细胞中加入CGO NF后ROS荧光显著减弱，[Ru(dpp)₃]Cl₂探氧荧光淬灭（产O₂），Western blot显示缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达下调，证实满意胞内ROS消除与缓解缺氧能力。

2.9 Intracellular anti-inflammatory and wound repair activity of CGO NF

脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导Raw 264.7为M1巨噬细胞（CD68 67.4%），200 ppm CGO NF处理使CD68降至44.9%、M2标志CD206从21.8%升至62.4%，促M1向M2极化。RNA测序显示LPS+CGO NF组相较LPS组，促炎基因（TNF-α、IL-6、CCL2等）下调，抗炎基因（IL-10、SOD1、MRC1）及促愈合基因（VEGF、FGF1）上调，KEGG富集TNF、Fc gamma R、趋化因子等免疫炎症通路激活改变。qRT-PCR与Western blot验证IL-6、TNF-α下调、IL-10上调。EdU与划痕实验示低浓度（峰值3 ppm）CGO NF促进3T3增殖（EdU阳性率升）与迁移（20 h闭合72.1% vs 对照52.6%），归因于中性CAT活性消ROS调免疫通路及微量Cu²⁺释出促愈合，Ge⁴⁺/Cu²⁺本身具抗炎性。

2.10 Wound infection therapy and healing of CGO NF

小鼠金黄色葡萄球菌感染全层皮缺损模型中，CGO NF+H₂O₂+NIR（0.3 W/cm²，5 s升至40.1 ℃，平台~64 ℃）组10天内伤口面积仅剩1.3%（闭合98.7%），余组剩56.3%-60.2%，CGO NF+H₂O₂组剩11.4%；菌落计数近无，炎症最轻。H&E、Masson、吉姆萨染色示该组表皮恢复完整、胶原沉积连续丰富、细菌极少；免疫荧光示ROS水平降、TNF-α表达减、VEGF增，证实体内促M1→M2极化、抗炎、促血管生成与再上皮化，CGO NF+H₂O₂+NIR治疗安全有效。

总结讨论部分：研究人员讨论指出，本研究首次通过简易水热-抽滤制得独立纯CGO纳米线NF敷料，其柔性、湿粘、吸液性适配敷料需求。酸性IMEs下靠高近红外吸收光热性能与POD样活性（GSH耗竭增ROS）行PTT/CDT协同抗菌/抗生物膜；菌清后微环境中性化自动切换CAT样活性消ROS，促巨噬M1→M2极化，调控TNF、Fc gamma R、趋化因子等免疫炎症通路抗炎愈创；Ge⁴⁺/Cu²⁺具抗炎性，微量Cu²⁺促修复；长缠结纳米线滞留伤口降全身毒。该安全有效、微环境响应自切换光热NF实现了自适应感染-炎症-修复级联，为低维无机纳米材料在环境敏感生物软材料提供新可能，为活性可切换纳米酶用于糖尿病伤口等氧化还原相关疾病开辟新径。未来需明晰CGO NF长期生物安全、催化稳定性与系统免疫应答以满足临床监管并降本放大以推转化。

研究结论部分原文翻译：

总之，研究人员的研究首次通过简便方法成功设计开发了由纳米线组成的独立纯CuGeO₃（CGO）纳米酶薄膜（NF）。得益于其柔性、湿组织粘附特性以及吸水/吸血能力，该NF被证明可作为伤口敷料。此外，因其在近红外（NIR）的高吸收带来的极其出色的光热性能，以及在酸性感染微环境（IMEs）中谷胱甘肽（GSH）消耗增强的过氧化物酶（POD）样活性产生ROS，使CGO NF具备优异的抗菌/抗生物膜效果，用于伤口感染的光热（PTT）/化学动力学（CDT）协同治疗。有趣的是，在感染根除后，酸性IMEs转变为中性微环境，激活CGO NF的酶活性自动且持续地切换为过氧化氢酶（CAT）样活性以清除过量ROS。这诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化，且免疫与炎症中的信号通路如肿瘤坏死因子（TNF）、Fc gamma R介导和趋化因子信号通路被激活。M2巨噬细胞极化导致抗炎与伤口修复。值得注意的是，CGO中的Ge⁴⁺和Cu²⁺本身可能具有抗炎能力，且Cu²⁺也能刺激伤口修复。同时，CGO NF较长且缠绕的纳米线结构倾向于滞留在伤口部位，将其对健康组织的毒性降至最低。因此，研究人员强调了一种安全、有效、活性可切换的光热NF敷料能够智能响应微环境变化，最终在伤口感染治疗与愈合中实现自适应感染-炎症-修复级联反应。这项工作不仅为微环境敏感生物医学软材料中的低维无机纳米材料提供了全新的可能性，也为开发用于其他氧化还原相关病理环境（如难治性糖尿病伤口与感染性疾病）的活性可切换纳米酶开辟了新途径。然而，未来研究应进一步阐明CGO NF的长期生物安全性、催化稳定性和系统免疫反应，以满足伤口敷料的临床监管标准，并通过大规模生产降低成本以最大化其临床转化潜力。