一种利用益生菌引导的口服生物杂交复合物通过原位疫苗接种治疗结直肠癌

《Materials Today Bio》：An orally administered biohybrid complex leveraging probiotic guidance to treat colorectal cancer via in situ vaccination

　　

结直肠癌（CRC）的口服疗法在提高患者依从性和实现胃肠道靶向方面具有固有前景，但其应用受到低口服药物利用效率和精准结肠定位的限制。本研究开发了一种口服递送的生物杂交复合物CS@CB-Lipo@5-FU/R837，该复合物利用益生菌丁酸梭菌（CB）的缺氧趋向性实现主动肿瘤靶向。该系统的核心由共载5-氟尿嘧啶（5-FU）和Toll样受体7（TLR7）激动剂R837的纳米脂质体组成，这些脂质体通过生物正交偶联定点锚定在CB上。基于壳聚糖（CS）的外层涂层可确保胃肠道稳定性，并在肿瘤定植环境中实现酶响应性药物释放。在肿瘤内，该复合物协调了协同的免疫治疗级联反应：5-FU诱导免疫原性细胞死亡（ICD），释放肿瘤抗原和损伤相关分子模式（DAMPs），而R837则促进树突状细胞（DC）成熟和抗原呈递。这种时空耦合的“抗原-佐剂”递送有效模拟了原位疫苗接种机制，刺激了强效的抗肿瘤免疫。在原位和皮下CRC模型中的评估显示，该治疗可导致肿瘤生长抑制、免疫微环境重塑和生存期延长。这项工作为基于益生菌引导递送和局部免疫激活的口服原位疫苗建立了一种多功能策略。

**论文解读：基于益生菌引导的口服生物杂交复合物通过原位疫苗接种治疗结直肠癌**

**1. 研究背景与问题**

结直肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，迫切需要更有效的治疗策略。传统化疗虽具细胞毒性，但因剂量限制性全身毒性、耐药性以及肿瘤特异性蓄积不足而常导致治疗失败。药物非特异性分布的挑战凸显了对创新递送平台的需求，以增强药物靶向肿瘤的能力。鉴于CRC复杂的发病机制，单一疗法效果有限，促使人们转向联合治疗策略，其中整合了化疗与免疫治疗的“化学免疫疗法”成为有前景的方法。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是CRC治疗的一线药物，但其口服生物利用度低、药代动力学高度可变，且即使静脉给药后肿瘤蓄积也仍不足。因此，提高5-FU在CRC组织中的局部浓度是改善治疗结局的重要策略。此外，5-FU在靶向增殖肿瘤细胞时，常因其对肿瘤微环境中免疫细胞的抑制作用而妥协，这可能促进免疫抑制状态。在此背景下，化疗-免疫治疗联合策略的优势凸显：通过引入免疫激动剂来抵消化疗的抑制作用，并协同增强抗肿瘤免疫。咪喹莫特（R837）是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的耐受性良好的TLR7激动剂，但具有高度疏水性，其靶点位于内体或溶酶体的内膜上，全身给药可能诱导过度免疫或脱靶效应。因此，亟需在肿瘤微环境内实现R837空间可控释放的策略。

口服给药是实现CRC治疗的理想途径，它利用生理连接实现天然靶向，同时显著提高患者依从性。然而，口服纳米载体在CRC治疗中的应用受到一个主要障碍的阻碍：大多数口服纳米制剂在上消化道过早释放或吸收，导致有效药物难以到达局部结直肠肿瘤，严重限制了药物在靶病灶的可及性，也难以诱导强效的局部抗肿瘤免疫反应。

益生菌因其出色的安全性、对恶劣胃肠道条件的固有抵抗力以及在肠道内的天然定植能力，已成为有前景的口服癌症治疗生物药物载体。此外，许多益生菌菌株具有固有的肿瘤归巢能力，尤其是对CRC病变中典型的缺氧和炎症区域。丁酸梭菌（CB）因其厌氧特性，已证明具有在缺氧肿瘤微环境中选择性蓄积的强大能力，是口服给药后精准靶向CRC的有吸引力的“生物导航载体”。然而，益生菌载体在到达结直肠肿瘤部位前，仍可能在上消化道面临生存障碍。为增强其在胃肠道转运过程中的活力，生物粘附性材料如壳聚糖（CS）已被广泛用于构建益生菌递送系统的保护涂层，显著提高了稳定性和结肠靶向蓄积能力。

**2. 主要技术与方法**

研究人员开发了一种口服递送的生物杂交复合物CS@CB-Lipo@5-FU/R837。主要技术方法包括：1）采用薄膜水化法合成共载5-FU和R837的DBCO功能化纳米脂质体（Lipo@5-FU/R837）；2）通过N₃-PEG₂₀₀₀-NHS对丁酸梭菌（CB）进行表面叠氮化修饰，利用无铜点击化学（SPAAC）实现脂质体与益生菌的生物正交偶联，构建CB-Lipo@5-FU/R837；3）通过静电吸附法在复合物外层包被壳聚糖（CS）涂层，形成CS@CB-Lipo@5-FU/R837。研究使用了CT26和MC38小鼠CRC细胞系，并建立了原位CT26-luc荧光素酶和皮下MC38肿瘤模型，肿瘤来源分别为Fenghui Biotechnology和COBIOER，动物实验遵循山东第一医科大学和山东省千佛山医院动物伦理委员会批准。

**3. 研究结果**

**3.1. CS@CB-Lipo@5-FU/R837的制备与表征**

研究人员成功制备了DBCO功能化的纳米脂质体，粒径约100 nm，对5-FU和R837的包封率分别达76%和82%。通过UV-vis、荧光凝胶分析和考马斯亮蓝染色证实，CB表面成功修饰了叠氮基团，且对细菌蛋白谱影响极小。透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）证实了CB-Lipo@5-FU/R837的成功构建，CS包被后粒径增大、Zeta电位由负转正，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）进一步验证了逐层组装。体外稳定性实验表明，CS涂层在模拟胃液（SGF）中保护复合物，并在含有β-葡萄糖苷酶的模拟结肠液（SCF）中酶解释放，实现了结肠特异性释放，累积释放率达80%。

**3.2. 体外抗肿瘤功效、细胞摄取与肿瘤球抑制**

CCK-8实验表明，Lipo@5-FU/R837对CT26和MC38细胞具有强效细胞毒性，而对L929成纤维细胞毒性低。流式细胞术（FCM）和活/死染色证实该制剂诱导了显著的细胞凋亡。CLSM和FCM显示，脂质体可被CT26细胞高效摄取，并能实现溶酶体逃逸。在3D肿瘤球模型中，CS@Lipo@5-FU/R837诱导了最持续和显著的体积缩小，表明其具有增强的肿瘤穿透能力。

**3.3. 体外免疫激活与ICD诱导**

FCM分析显示，CS@CB-Lipo@5-FU/R837处理组显著促进了骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的成熟（CD80⁺CD86⁺比例升高），并有效将M2型巨噬细胞（CD206⁺）重编程为M1型（CD86⁺），提高了M1/M2比例，同时伴随促炎因子（TNF-α, IL-6, IL-12）升高和抗炎因子（IL-10）降低。该复合物还诱导了强效的ICD，表现为钙网蛋白（CRT）膜暴露增加、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放以及ATP外排显著增多。

**3.4. 体内生物分布与药代动力学**

在原位CT26-luc CRC模型中，活体成像显示，CS@CB-Lipo@DiR组在24小时时仍维持腹部高荧光信号，离体成像证实其肿瘤特异性蓄积最高，且肝脏分布减少。组织菌落计数显示，CS涂层显著延长了CB在结肠的滞留时间，并增强了其在肿瘤组织中的定植。药代动力学分析表明，CS@CB-Lipo@5-FU/R837组具有最高的血药峰浓度（C_max）和药时曲线下面积（AUC），同时实现了结肠和肿瘤组织中5-FU的最高蓄积。

**3.5. 原位与皮下CRC模型的抗肿瘤疗效与安全性**

在原位CRC模型中，CS@CB-Lipo@5-FU/R837（G7）组表现出最强的肿瘤生长抑制，肿瘤体积和重量最小，且中位生存期超过30天，显著长于其他组。H&E染色显示肿瘤组织广泛坏死，Ki67表达降低，TUNEL阳性细胞增多，ICD标志物（CRT, HMGB1）表达显著上调。在皮下MC38模型中，G7组同样有效抑制肿瘤生长，延长生存期，并显著增加了肿瘤内CD4⁺和CD8⁺ T细胞的浸润。安全性评估显示，主要器官病理学检查及血液学、生化指标均无显著异常，表明该口服系统具有良好的生物相容性。

**3.6. 重塑免疫抑制微环境并增强抗肿瘤免疫**

免疫分析表明，CS@CB-Lipo@5-FU/R837（G7）组显著增加了肿瘤浸润CD8⁺ T细胞比例，提高了CD8/CD4比值，并诱导了CD44⁺CD62L^-效应记忆T细胞的形成。该组M2型TAMs（CD206⁺）减少，M1型（CD86⁺）增加，M1/M2比值最高。在脾脏中，成熟的DCs（CD80⁺CD86⁺）增加，调节性T细胞（Tregs, Foxp3⁺CD4⁺）减少，CD8⁺ T/Tregs比值升高。肿瘤内颗粒酶B（GZMB）、TNF-α和IFN-γ水平升高，IL-10降低。免疫组化染色显示，G7组肿瘤组织中CD69⁺和CD103⁺组织驻留记忆T细胞（TRM）比例显著增加，阳性率分别达69.8%和65.42%。在肿瘤再挑战模型中，G7组显著抑制了继发性肿瘤的生长，并观察到CD8⁺ T细胞浸润增强、DCs成熟、M1型巨噬细胞极化和Tregs减少。

**3.7. 肠道菌群调节**

16S rRNA基因测序分析显示，CS@CB-Lipo@5-FU/R837处理未显著改变肠道菌群的α多样性，但改变了菌群组成。在门水平，厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）升高，导致Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值降低。在属水平，乳杆菌属（Lactobacillus）和阿克曼氏菌属（Akkermansia）等有益菌属富集。LEfSe分析鉴定出CS@CB-Lipo@5-FU/R837组中显著富集的特定细菌分类单元。

**4. 讨论与结论**

**讨论部分总结：** 研究人员开发的CS@CB-Lipo@5-FU/R837口服复合物有效克服了CRC治疗中靶向效率低和肿瘤蓄积不足的挑战。该系统通过整合CB的生物趋向性、纳米脂质体的共载功能、生物正交偶联的稳定性以及CS涂层的保护与酶响应释放特性，实现了时空可控的肿瘤特异性药物递送。该平台通过在肿瘤微环境中诱导ICD释放抗原，并同步释放R837激活免疫，模拟了原位疫苗接种机制，从而重塑免疫抑制微环境，增强CD8⁺ T细胞介导的细胞毒性和肿瘤浸润，并成功诱导了长期免疫记忆（表现为CD69⁺CD103⁺ TRM细胞增加）。此外，该复合物还能调节肠道菌群至更有利的组成，可能通过短链脂肪酸（SCFAs）等代谢物进一步发挥协同抗肿瘤作用。该研究为口服化学免疫疗法提供了一种安全有效的策略，并为基于益生菌引导的精准口服递送系统的发展奠定了基础。

**研究结论部分翻译：** 本研究开发了一种可口服给药的复合物（CS@CB-Lipo@5-FU/R837），以克服CRC治疗中靶向效率低和肿瘤蓄积不足的挑战。该系统整合了CB作为生物营养载体，利用了其严格厌氧性和固有的肿瘤归巢能力。共载5-氟尿嘧啶（5-FU）和TLR7激动剂R837的纳米脂质体通过生物正交化学定点偶联至CB，并封装在CS涂层内，以提供胃肠道保护并在结肠中实现酶响应性释放。到达结肠后，CS壳被β-葡萄糖苷酶降解，释放出CB引导的治疗性货物，从而促进肿瘤特异性药物递送。局部高浓度的5-FU诱导ICD，伴随肿瘤相关抗原和损伤相关分子模式的释放；同时，R837激活树突状细胞并促进巨噬细胞向M1表型极化，协同增强抗肿瘤免疫。这种益生菌引导的平台，作为一种口服原位疫苗，为CRC化学免疫疗法提供了一种安全有效的策略。纳米技术与益生菌介导递送的结合，为开发精准口服药物递送系统奠定了坚实基础，并具有治疗多种肠道疾病的潜在应用前景。