器官型外宫颈粘膜模型用于研究性传播感染的宿主-病原体相互作用

《Materials Today Bio》：An organotypic ectocervix mucosa model to study host-pathogen interaction of sexually transmitted infections.

　　

器官型模型紧密重现了体内人类组织和器官，从而克服了动物和常规细胞培养在研究人类特异性感染方面的局限性。性传播病原体对女性生殖道的感染通常始于下生殖道，包括阴道和外宫颈，然后上行至上生殖道。这些下生殖道感染通常无症状，促进了伴侣之间的无声传播，并因延迟诊断和治疗而导致严重并发症。然而，由于缺乏相关模型以及检测临床无症状感染的挑战，研究主要集中在有症状的上生殖道（FRT）感染。研究人员提出了一种器官型人类外宫颈粘膜（hEcCxM）模型，该模型通过在塑料压缩胶原支架上共培养原代外宫颈上皮细胞和成纤维细胞生成。组织学分析和单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，hEcCxM模型形成了复层鳞状上皮，并表现出其生理屏障功能所必需的关键特征。hEcCxM模型的转录保真度通过与原位外宫颈组织进行验证。该模型重现了淋病奈瑟菌（GC）和沙眼衣原体（Ctr）的几种体内感染表型。GC感染诱导了促炎细胞因子的分泌，而Ctr感染未引发类似的炎症反应。此外，研究人员证明中性粒细胞可以从基底侧迁移至感染部位，但这需要内皮层的存在。总体而言，hEcCxM模型代表了一个可扩展且生理性的平台，用于研究性传播感染以及影响外宫颈粘膜的非感染性疾病中的宿主-病原体相互作用。

性传播感染（STIs）是全球公共卫生的重大挑战，淋病奈瑟菌（GC）和沙眼衣原体（Ctr）是最常见的两种细菌性病原体。女性下生殖道（包括外宫颈和阴道）是这些病原体的主要入侵部位，但感染常无症状，导致隐匿传播和严重并发症，如盆腔炎、不孕和异位妊娠。现有研究多依赖二维（2D）细胞培养和动物模型，但这些模型无法完全重现人类组织的细胞异质性、极性和微生理环境，且动物模型存在种属特异性限制。因此，开发更接近人体生理条件的体外模型对于理解宿主-病原体相互作用至关重要。研究人员构建并验证了一种器官型人外宫颈粘膜（hEcCxM）模型，并证明其能模拟GC和Ctr的感染过程及中性粒细胞迁移，为研究STIs提供了可靠平台。该研究发表在《Materials Today Bio》。

关键技术方法方面，研究人员从接受子宫切除术的患者（来源：德国维尔茨堡大学医院）中分离原代外宫颈上皮细胞和成纤维细胞，通过塑料压缩胶原支架构建共培养体系，在气液界面下培养21天形成分化粘膜。主要技术包括：组织学染色（HE、PAS）和免疫荧光分析；单细胞RNA测序（scRNA-seq，10x Genomics）和生物信息学整合（与公开导管scRNA-seq数据集对比）；电子显微镜（TEM、SEM）观察超微结构；GC（菌株MS11）和Ctr（血清型K和L2）感染实验，通过菌落形成单位（CFU）和定量PCR（qPCR）量化病原体载量；中性粒细胞（PMN）迁移实验，结合人脐静脉内皮细胞（HUVEC）层和细胞因子分析（LEGENDplex多重免疫分析）。

研究结果分为四个部分：

**3.1 器官型外宫颈粘膜模型显示出天然人外宫颈粘膜的典型特征**：通过HE、PAS染色和免疫荧光，研究人员观察到复层鳞状上皮、糖原积累和连接蛋白（E-cadherin）的表达模式，TEM显示从基底到顶层的分层结构。scRNA-seq分析鉴定出8个细胞亚群，包括基底、中间、表层上皮细胞和成纤维细胞亚群。伪时间分析揭示了从基底细胞向终末分化的发育轨迹。整合分析显示，模型与天然外宫颈组织的上皮和成纤维细胞亚群在转录组水平高度一致（Spearman相关系数约0.70），表明模型重现了体内细胞类型和组织结构。

**3.2 淋病奈瑟菌粘附并侵入hEcCxM模型**：scRNA-seq显示模型表达GC受体（如CEACAM1/5/6、SDC1/4、CD46）。感染后，GC在30小时形成微菌落，并局限于上皮损伤区域；96小时内细菌载量增加918倍。TEM观察到GC在细胞内和细胞间隙的多种感染表型，包括膜突起、囊泡形成和细胞内膜结合簇。感染诱导了促炎细胞因子（IL-6、IL-8、IL-1β、IL-18）的显著分泌，模拟了体内炎症反应。

**3.3 沙眼衣原体感染并在hEcCxM模型中复制**：模型表达Ctr受体（如EGFR、ITGB1、EPHA2、HSPG2）。感染后，Ctr包涵体局限于顶层上皮细胞，TEM显示包涵体内含有原体（EB）和网状体（RB），表明完成发育周期。96小时内，Ctr基因组拷贝数随时间增加，但来自不同供体的模型间存在差异；感染性实验证实72小时后可产生感染性子代。Ctr感染未显著诱导细胞因子分泌，与GC形成对比，表明其免疫逃逸特性。

**3.4 中性粒细胞整合到hEcCxM模型中**：模型表达模式识别受体（TLR、NLR、RIG）和抗菌肽。中性粒细胞迁移实验显示，PMN需在内皮细胞层存在时才能穿过1毫米厚的压缩胶原支架。在GC感染模型中，PMN从基底侧迁移至上皮感染部位；而在Ctr血清型K感染中，PMN迁移不明显，但血清型L2感染诱发了更强的PMN招募，提示血清型依赖性差异。

讨论部分，研究人员指出模型在细胞类型和转录组层面与天然组织高度相似，但存在结构厚度和细胞比例差异，这反映了模型环境中缺乏免疫细胞和基质细胞。模型成功重现了GC和Ctr的关键感染特征，如GC诱导的细胞因子分泌和中性粒细胞浸润，以及Ctr的潜伏感染特性。研究结论部分翻译如下：总之，研究人员成功开发并验证了一种器官型人外宫颈粘膜模型（hEcCxM），该模型紧密重现了天然外宫颈粘膜的转录组、细胞结构和组织结构。hEcCxM代表了一个生理相关平台，用于研究由人类特异性病原体引起的泌尿生殖道感染以及外宫颈粘膜的非感染性疾病。该模型能够支持长期生产性感染，结合其转录保真度，使其成为评估新型抗菌剂和疫苗衍生抗体等干预策略的有价值工具。此外，该模型通过提供人类相关的动物模型替代品，促进了3R原则的实施，特别是针对人类特异性病原体的研究。平台的模块化设计具有扩展性，例如整合多种免疫细胞、微生物群和激素，以研究上皮-免疫相互作用、菌群失调和周期依赖性感染易感性，从而深入探索女性生殖道感染的潜在机制。