意大利利古里亚地区脊髓性肌萎缩症与重症联合免疫缺陷联合新生儿筛查的五年经验

《European Journal of Human Genetics》：Five-year experience of a combined newborn screening for spinal muscular atrophy and severe combined immunodeficiency in Liguria, Italy

　　

针对脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）和重症联合免疫缺陷（Severe Combined Immunodeficiency，SCID）的联合新生儿筛查项目在意大利利古里亚地区通过一项为期五年的试点研究进行了评估，共纳入32,289名新生儿。基于干血斑（Dried Blood Spot，DBS）样本的单次多重实时聚合酶链式反应（real-time PCR）检测，可同时检测SMN1第7外显子缺失并定量T细胞受体切除环（T-Cell Receptor Excision Circles，TREC）和κ删除重组切除环（Kappa-Deleting Recombination Excision Circles，KREC），从而实现了接近全人群覆盖和较低的召回率。共有10名新生儿获得目标疾病的确诊诊断：其中5名新生儿被诊断为脊髓性肌萎缩症（SMA），4名在症状出现前接受治疗并获得良好的临床结局，另1名0型SMA患儿于出生后数日内死亡；另有5名新生儿被诊断为免疫缺陷，包括2例腺苷脱氨酶（Adenosine Deaminase，ADA）相关重症联合免疫缺陷（SCID），以及3例具有临床意义的次级发现（特发性T细胞淋巴细胞减少症、DiGeorge综合征和一过性B细胞淋巴细胞减少症）。随访期间未观察到假阴性病例。TREC和KREC谱与其基础免疫学诊断一致。总体而言，该研究表明，SMA与SCID联合新生儿筛查具有可行性、可靠性和明确的临床影响，支持将其整合入公共卫生筛查项目。

该文发表于《European Journal of Human Genetics》，报道了意大利利古里亚地区开展脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）与重症联合免疫缺陷（Severe Combined Immunodeficiency，SCID）联合新生儿筛查（Newborn Screening，NBS）的五年试点经验。研究背景在于，新生儿筛查是二级预防体系中的核心组成部分，其关键价值在于于临床症状出现前识别严重但可干预的遗传性或免疫性疾病，从而显著改善患儿预后并降低长期社会负担。传统NBS主要依赖生化指标检测，而分子诊断技术的发展推动筛查平台从单指标分析转向高通量、多重DNA检测。SMA约95%由SMN1第7外显子纯合缺失引起，若在出生后尽早接受疾病修正治疗，可显著改善运动结局；SCID则是一组出生时常无特异表现、但若未及时治疗可在婴幼儿早期致死的严重免疫缺陷，TREC定量已被证明适用于早期筛查。尽管SMA或SCID单病种筛查已在多国建立，但如何以单份干血斑（DBS）样本实现联合、标准化、低召回率的区域性筛查，仍需真实世界数据加以验证，因此研究人员开展了本项前瞻性试点研究。

研究人员于2021—2025年在意大利利古里亚地区建立综合分子NBS流程，旨在构建并验证基于单份DBS的SMA与SCID联合筛查方案，建立人群参考范围，优化分析前与分析后流程，评估联合分子筛查的可行性和检测性能，并估算区域出生患病率。研究最终证明，该联合方案在区域公共卫生体系内可稳定运行，覆盖率高、阳性预测值高，并可实现对SMA与免疫缺陷患儿的及时识别和快速转诊。对于SMA，症状前治疗与良好临床结局密切相关；对于SCID，TREC/KREC联合分析不仅能识别目标疾病，也能检出具有临床意义的非SCID淋巴细胞减少状态。该研究的重要意义在于为意大利首次SMA与SCID联合NBS实施提供了系统证据，并为其纳入更大范围公共卫生筛查政策提供了地区性依据。

研究人员采用的主要技术方法包括：在利古里亚地区全部10家分娩中心对取得监护人书面知情同意的新生儿开展前瞻性队列筛查；于出生后48–72 h采集足跟血制备DBS；采用单次多重实时PCR同时检测SMN1第7/8外显子纯合缺失并定量TREC、KREC，以RPP30作为内参；对初筛阳性或临界结果于原始DBS上重复检测，必要时召回采集第二份DBS；SMA阳性个体以多重连接依赖式探针扩增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）确认SMN1/SMN2拷贝数，免疫缺陷阳性个体结合血常规、淋巴细胞亚群分析及三联体扩展外显子检测进行确诊。

以下为研究结果的主体解读。

Study design and participants
研究采用前瞻性试点设计，面向利古里亚地区所有新生儿提供联合筛查。项目由区域伦理委员会批准，并由IRCCS Istituto Giannina Gaslini、热那亚大学、利古里亚地区卫生主管机构及地区全部10家分娩中心协作实施。样本采集依托常规区域NBS体系开展，保证了样本来源的连续性、区域代表性和实际可推广性。

Biological sample collection and processing
研究人员在出生后48–72 h采集足跟血，制备DBS，并使用3.2 mm冲孔样本进行DNA提取。核心筛查平台为单次多重实时PCR，可在同一反应体系中完成SMA相关SMN1缺失分析以及SCID相关TREC/KREC定量。对初筛SMN1无扩增和/或TREC、KREC低于阈值且RPP30正常者，于24–48 h内在同一DBS样本上重复检测；结果再次支持阳性时，启动临床诊断流程并要求第二份DBS复检。该流程体现了从初筛、复核到临床转诊的闭环管理。

Diagnostic confirmatory testing
确诊工作集中在IRCCS Giannina Gaslini Institute完成。SMA通过MLPA检测SMN1和SMN2第7、8外显子拷贝数，从而完成病理性纯合缺失确认并评估SMN2拷贝数这一关键修饰因素。SCID及相关免疫缺陷则通过血细胞计数、淋巴细胞亚群分析以及覆盖联合免疫缺陷和SCID相关基因的扩展外显子检测加以确认。研究同时将病原性和可能病原性变异提交至LOVD数据库，表明其在遗传数据规范化方面具有较高标准。

Data analysis
研究基于利古里亚新生儿人群建立TREC与KREC阈值，其中参考队列为3000名健康新生儿。最终筛查截断值设定为TREC 223 copies/10⁵ cells、KREC 108 copies/10⁵ cells；SMN1第7–8外显子无扩增者判定为SMA筛查阳性。该部分结果说明，本研究并非直接套用外部标准，而是进行了人群特异性的本地化阈值构建，这是降低假阳性和提高筛查适配性的关键步骤。

Results
在2021年9月4日至2025年8月31日期间，共检测32,289份DBS样本，筛查接受率达99.8%。初筛阳性共654例，占2.0%，其中疑似SCID 649例、疑似SMA 5例；经同一DBS重复检测后，仅38例需采集第二份DBS，占0.12%。第二份DBS分析后，28例疑似SCID被归为筛查阴性，最终仍为筛查阳性的共有10例，并全部经诊断证实，阳性预测值（Positive Predictive Value，PPV）为100%。所有筛查阳性个体均接受即时随访，无失访病例。临床召回中位年龄为13 d，提示该流程在时效性方面具有较高执行力。研究期间地区临床单位未报告假阳性健康新生儿转诊，也未发现假阴性病例。

Spinal muscular atrophy (SMA)
共确诊5例SMA。首例为2021年11月发现的女性新生儿，诊断为1型SMA，SMN1第7、8外显子纯合缺失且SMN2为2拷贝，临床已有肌张力低下和四肢腱反射消失表现，于生后第26天接受基因治疗，随访显示发育里程碑良好，17月龄时可独立行走。第二例为2022年5月确诊的足月女婴，存在自发运动减少，遗传学显示SMN1第7、8外显子纯合缺失且SMN2仅1拷贝，诊断为0型SMA，虽早期即被怀疑，仍于出生后数日内死亡。第三例为2023年12月经常规NBS发现的无症状男婴，SMN2为3拷贝，于生后第14天开始接受nusinersen治疗。第四、第五例分别于2024年6月和2025年4月检出，均为女性、诊断时无症状、SMN2为4拷贝，分别于生后第25天和第13天开始接受risdiplam治疗。上述结果显示，SMA的出生后分子筛查可实现不同临床阶段的识别，而SMN2拷贝数有助于风险分层与治疗决策；对1–3型相关谱系，症状前干预价值突出，但对宫内起病的0型SMA，即使极早发现和治疗，疾病轨迹仍可能难以改变。

TREC and KREC screening positive cases
免疫缺陷相关筛查阳性共5例。第一例于2022年3月确诊，为TREC降低的足月女婴，流式细胞术显示T细胞淋巴细胞减少，但未达到SCID诊断标准，且未检出致病变异，最终分类为孤立性特发性T细胞淋巴细胞减少症，并持续随访且建议避免接种减毒活疫苗。第二例于2023年1月因TREC降低被召回，免疫分型示CD3+淋巴细胞减少，遗传学发现TBX1杂合缺失，细胞遗传学证实为del(22)(q11.2q11.2)，符合DiGeorge综合征。第三例于2023年8月因TREC/KREC均不可检出而被召回，结合家族免疫缺陷史和DBS中腺苷代谢物升高，提示ADA缺陷；遗传学证实ADA致病纯合变异c.956_960del，p.Glu319Glyfs3，同时WES发现CD3G新发纯合变异c.213dup，p.Trp72Metfs6，提示可能存在双分子诊断。研究将ADA缺陷视为主要代谢驱动因素，而CD3G缺陷可能加重T细胞淋巴细胞减少和整体表型；患儿于生后第12天启动酶替代治疗，并转介评估基因治疗。第四例于2023年11月因KREC低而TREC正常被召回，初始表现为孤立性B细胞缺乏，3个月时恢复正常，WES发现TAPBP和ADA杂合变异，临床上归为一过性B细胞淋巴细胞减少症。第五例于2024年10月因TREC/KREC双低且腺苷代谢物升高被召回，遗传学显示ADA复合杂合变异，确诊ADA-SCID；召回后14 d完成诊断，迅速启动酶替代治疗，并于8月龄接受基因治疗。该组结果表明，TREC/KREC谱与基础免疫学缺陷高度一致，也说明联合检测不仅可发现经典SCID，还可识别具有临床管理价值的次级免疫学异常。

Discussion
讨论部分强调，分子生物学方法进入NBS后，显著提升了疾病早期识别的灵敏度与特异度。该研究证实，采用单个3.2 mm DBS和单次多重实时PCR进行SMN1、TREC和KREC同步检测，在区域公共卫生场景下具有高度可行性。研究估算利古里亚地区SMA出生患病率约为1:6433，SCID约为1:16,084，与近期意大利研究相符；接近完整的出生队列使这些估计具备一定参考价值，但作者同时明确指出，受限于样本量和研究时长，这些频率数据仍需谨慎解释。研究还指出，EONIS SCID-SMA试剂体系带来了很低的假阳性和召回比例，有助于降低家庭焦虑并优化卫生资源配置。对SMA而言，症状前治疗获得良好运动结局，进一步支持NBS与个体化治疗整合；对免疫缺陷而言，虽然本项目的主要筛查目标是SCID，但次级发现如非SCID淋巴细胞减少仍具有现实临床价值，因为其可触发专科随访和疫苗管理。研究同时承认局限性，包括单一区域设计、样本量较小、缺乏正式成本效果分析、随访时间较短，因而尚不足以评价长期运动功能、生活质量及免疫重建持久性。

研究结论部分可译为：本研究代表了意大利首个SMA与SCID联合新生儿筛查项目的实施。研究结果表明，在区域NBS框架内整合针对这些严重疾病的分子检测具有可行性、准确性和操作上的可持续性。该项目使10名受累新生儿获得了早期诊断和及时治疗，从而改善了临床结局，并证实了SMN1、TREC和KREC多重检测较高的诊断产出。尽管结果显示识别非SCID淋巴细胞减少具有临床效用，但研究并不主张立即将所有T细胞淋巴细胞减少类型扩展纳入官方NBS目标疾病。应当区分主要筛查目标（SCID）与这些次级发现。该研究经验提示，基于TREC的筛查方法本质上会识别更广泛且具有临床相关性的免疫学缺陷，但这些情况应作为需要专科诊断随访的次级发现进行管理，而非归类为主要筛查目标。研究还提供了通过NBS检出的SMA与SCID地区特异性初步数据，可为其纳入国家NBS政策及欧洲流行病学基准提供支持；不过鉴于本试点研究样本量和持续时间有限，这些发现需谨慎解读，尚不能对疾病频率作出确定性结论。整体而言，该项目所采用的精简多重流程显示出良好效率，并与现有公共卫生基础设施兼容，体现出分子NBS不仅能够服务于早期检出，也可进一步发展为新生儿医学中精准预防与个体化照护的平台。