《Molecular & Cellular Proteomics》：‘If the shoe fits?’ – Benchmarking plasma proteomic sample-preparation workflows across human and rat biofluids
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对新型临床生物标志物的推动促进了生物体液分析的快速创新，尤其是在血浆方面。对于基于质谱（MS）的分析，在确保通量的同时实现深度和定量准确性，持续塑造着血浆方法的开发。许多工作流程已经出现，用于减轻高丰度抑制并扩展动态范围，尤其是在与下一代MS仪器结合时。然而，
对新型临床生物标志物的推动促进了生物体液分析的快速创新，尤其是在血浆方面。对于基于质谱（MS）的分析，在确保通量的同时实现深度和定量准确性，持续塑造着血浆方法的开发。许多工作流程已经出现，用于减轻高丰度抑制并扩展动态范围，尤其是在与下一代MS仪器结合时。然而，同时考虑生物学变量（例如，生物体液类型、物种）和技术参数（例如，MS方法）的系统性评估仍然有限。在此，研究人员对八种样本制备工作流程进行了基准测试，涵盖直接处理（SP3、STrap）、消耗（高氯酸，PerCA）和冠层富集（MagNet HILIC/SAX、Enrich-iST、ProteoNano）策略。研究人员比较了它们在人类血浆、人类血清和大鼠血浆中的性能，使用两种血浆优化的数据非依赖性采集（DIA）方法在Orbitrap Astral（Thermo）上分析所有样本：一种最大化发现，一种最大化通量。研究人员在各种工作流程和方法中鉴定了2,726种人类蛋白和3,767种大鼠蛋白，包括来自直接处理血浆的约1,000种。增加通量导致深度降低约20-30%，具体取决于工作流程和物种。EV富集产生了最深的蛋白质组，但其组成相对于直接处理、消耗和分泌蛋白富集样本有显著差异，揭示了一个独特的亚蛋白质组生态位。几种工作流程在大鼠血浆中表现显著更好，支持对临床前分析提高的敏感性。富集或消耗显著重塑了血浆中可检测的组织和细胞特异性蛋白的平衡，表明工作流程的选择应由与研究最相关的器官、免疫靶点或炎症信号指导。在这方面，对差异丰度蛋白的统计分析显示，工作流程之间>90%的检测蛋白发生了显著改变，其中数量最多的来自冠层富集策略，强调了工作流程选择如何强烈影响下游蛋白质组。综合来看，这些发现强调了一个快速扩张的血浆方法学领域，其中最有效的工作流程是最精确地针对队列生物学特性的工作流程。
论文解读文章：
研究背景：血浆蛋白质组学在生物标志物发现中占据核心地位，但血浆中蛋白动态范围极宽（前20种高丰度蛋白占99%质量），严重抑制低丰度组织泄漏和免疫相关蛋白的检测。尽管近年来质谱（MS）技术、数据非依赖性采集（DIA）方法和新型富集工作流程（如功能化纳米颗粒）快速发展，使得血浆蛋白质组深度大幅提升（HUPO Plasma Proteome Project参考库中规范蛋白数从213增至4,608），但系统性评估这些方法在跨物种（人类与啮齿动物）和跨生物体液（血浆与血清）中的表现仍有限。现有基准研究多聚焦于单一物种或单一技术参数，缺乏对生物学变量（如物种特异性动态范围）和技术变量（如MS方法）的联合考量。因此，研究人员开展本研究，旨在比较多种样本制备工作流程在人类和大鼠血浆及血清中的性能，为临床前和临床研究提供方法选择依据。
研究人员开展的研究：研究人员采用八种样本制备工作流程，包括两种直接处理法（STrap、SP3）、一种消耗法（高氯酸沉淀，PerCA）和五种冠层富集法（MagNet HILIC、MagNet SAX、MagNet HILIC/SAX组合、EnrichIST、ProteoNano），分别在人类血浆、人类血清和大鼠血浆（来自Sprague-Dawley大鼠，Monash Animal Research Platform）中测试。所有样本在Orbitrap Astral质谱仪上使用两种血浆优化的DIA方法分析：一种为最大化发现的“发现”方法（65分钟梯度，300 ng上样），另一种为最大化通量的“通量”方法（30分钟梯度，150 ng上样）。通过Spectronaut进行无库搜索，比较不同工作流程的蛋白鉴定深度、定量重现性、动态范围压缩效果以及组织/细胞特异性蛋白富集模式。研究结论：无一种工作流程适用于所有场景，选择需基于目标生物学问题；冠层富集方法（尤其是MagNet）在人类和大鼠血浆中均能实现最深蛋白质组，但显著改变血浆蛋白组成，且物种特异性动态范围影响工作流程性能；直接处理法在下一代MS下可轻松突破1,000蛋白鉴定，但通量提升导致深度降低20-30%。重要意义：研究为临床蛋白质组学方法选择提供了系统参考，强调工作流程应与队列生物学特性（如器官靶点、免疫信号）精准匹配，并首次系统评估了跨物种适用性，证明了临床前模型（大鼠）中方法优化的可行性，为生物标志物发现和转化研究奠定基础。论文发表在《Molecular》。
关键方法：1. 样本制备工作流程：直接处理（STrap、SP3）、消耗（PerCA）、冠层富集（MagNet HILIC/SAX、EnrichIST、ProteoNano），所有样本来自健康人类捐赠者（Monash University Human Research Ethics Committee批准）和11周龄Sprague-Dawley大鼠（Alfred Medical Research & Education Precinct Animal Ethics Committee批准）。2. 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）：Orbitrap Astral质谱仪，配备等离子体优化的两种DIA方法（发现方法：65分钟梯度，Aurora Ultimate色谱柱；通量方法：30分钟梯度，Aurora Elite色谱柱）。3. 数据分析：Spectronaut（v19.4）进行无库DIA搜索，MaxLFQ定量，使用DIA Analyst进行差异丰度蛋白（DAP）统计，STRING-DB进行功能富集，Baize工具评估血小板/红细胞污染。
研究结果：
1. 工作流程评估、物流与肽段回收率：八种工作流程（72个样本）由三名技术人员两天内平行制备。PerCA工作流程最耗时复杂，蛋白回收率最低（0.12%，4.17 μg），而STrap直接处理回收率最高（83.1%，29 μg）。两种MS方法（发现vs通量）在活性梯度和上样量上差异显著。
2. 工作流程特异性富集与通量-检测权衡：共鉴定2,726种人类蛋白（来自27,465条肽段）和3,767种大鼠蛋白（来自40,215条肽段）。直接处理法中，STrap在血浆中鉴定蛋白数高于SP3，但平均肽段/蛋白比略低。冠层富集方法（MagNet）在人类和大鼠中均达到最高鉴定深度（>1,700人类蛋白，>3,000大鼠蛋白，发现方法），但通量方法导致深度降低约20-30%，在人类生物体液中更显著（28.9% vs 25.6%）。PerCA消耗在人类中显著提升鉴定数，但大鼠中与直接处理法相当，且肽段/蛋白比最低。ProteoNano不适用于人类血清，呈明显血浆偏好。
3. 探索生物体液、物种和方法特异性性能：主成分分析（PCA）显示工作流程间显著分离，三个MagNet变异体在坐标上几乎重叠，与PerCA和直接处理法分离。大鼠血浆中，冠层富集方法贡献了38%的蛋白不在直接处理或消耗方法中检测到。蛋白质密度图显示，直接处理法在人血浆中右尾更明显（高丰度蛋白抑制更强），而大鼠血浆中低丰度蛋白检测改善，冠层富集方法（尤其MagNet）显著压缩动态范围，低丰度蛋白计数翻倍。变异系数（CV）分析显示，MagNet HILIC和EnrichIST在跨生物体液和物种中具有最低且一致的变异，表明其最可靠。
4. 工作流程与血浆参考数据库的覆盖：以STrap直接处理为基线，冠层富集方法（尤其MagNet）成功降低了前100种高丰度血浆蛋白强度，而PerCA消耗反而增加其强度，反映整体强度分布右移。EV标志物（ExoCarta Top 100）在MagNet工作流程中检测最多，直接处理法和EnrichIST最低。人类蛋白质组计划（HPP）蛋白覆盖率达82.7-87.4%，Olink 3K靶标覆盖率仅39.8-43.9%，显示MS与抗体依赖方法互补性。
5. 探索消耗与富集蛋白质组的细胞和组织特异性起源：映射至血浆组织/细胞图谱（18种组织，8种免疫细胞），MagNet工作流程显著富集免疫细胞标志物（巨噬细胞、单核细胞、T细胞），与循环EV一致。PerCA消耗则富集组织特异性标志物（食管、皮肤、肾上腺），且与MagNet共享的脑特异性标志物仅55.9%。强度比例分析显示，B细胞标志物（免疫球蛋白）占直接处理法强度一半，在其它工作流程中减少逾一半。血小板标志物在MagNet中最高，但仅ProteoNano在Baize工具中呈阳性。大鼠同源映射显示，跨物种共享标志物仅21.1%，且冠层富集工作流程在物种间富集类别反转（除MagNet SAX-HILIC外）。
6. 工作流程间差异丰度蛋白的统计评估：DIA Analyst分析显示，几乎所有蛋白（>96%）在至少一个工作流程比较中显著差异。分层聚类显示工作流程特异性富集模式，大鼠中MagNet类群富集蛋白稳态复合体（蛋白酶体、溶酶体、伴侣蛋白），PerCA类群富集皮肤相关术语（角蛋白、中间丝）。人类中MagNet类群富集细胞外基质组织与细胞黏附，PerCA富集表皮分化。冠层方法间比较：MagNet SAX与HILIC在大鼠中差异最小（49 DAPs，0.001%），人类中较高（150-110 DAPs）；EnrichIST与MagNet间差异最大（大鼠中43.5%，人类中55.4%），表明冠层化学依赖性显著重塑蛋白质组。
讨论与结论：血浆作为动态且复杂的生物体液，其蛋白质组在不同生理和病理状态下差异显著。研究人员强调，无一种工作流程适用于所有场景，选择需基于目标队列的生物学特性（如器官、免疫信号、炎症状态）。研究结论翻译：血浆仍是一种动态且本质上复杂的生物体液，用于蛋白质组评估，不仅因为其高丰度蛋白，还因为其组成在生理和病理中的可塑性。在这些背景下，血浆蛋白质组与健康基线及彼此之间发生深刻分歧。随着临床医生和研究人员要求严格的临床蛋白质组学，方法选择必须由给定队列中的物种、症状学和全身反应指导：最可能改变的是什么，哪种工作流程最适合捕捉它？这并非简单地承认方法“偏向”某些蛋白，尽管必须接受某些工作流程对试管相关和其他技术伪影敏感。更确切地说，这是承认不同工作流程照亮了血浆蛋白质组的不同子集和子系统，同时可能减少其他部分的代表性，并显著重塑天然生物体液被观察的方式。适当的工作流程选择只能在临床前/临床队列、目标生物学以及样本采集和处理的前分析背景下定义。没有一刀切的解决方案，只有机会（或陷阱）选择最适合当天、目的地和着装要求的最佳方案。
