特发性肺纤维化中黏膜和淋巴样低功能颗粒酶K产生CD8+效应记忆T细胞的积累

《Mucosal Immunology》：Accumulation of mucosal and lymphoid hypo-functional granzyme K producing CD8+ effector memory T cells in idiopathic pulmonary fibrosis

　　

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性肺部疾病，其特征在于肺实质快速瘢痕形成，导致气体交换受损和早期死亡。目前的治疗选择有限；肺移植仍然是唯一的根治性治疗。适应性免疫系统越来越被认为是疾病起始或进展的潜在因素。研究人员使用光谱流式细胞术（spectral flow cytometry）、免疫荧光成像（immunofluorescence imaging）和体外功能测定（in-vitro functional assays），研究了从IPF患者和非疾病对照的移植肺和肺引流淋巴结（HLN）中获得的T细胞。研究人员发现，与对照组相比，IPF肺和HLN中积累产生颗粒酶K（granzyme K）的低功能CD8⁺ T细胞。研究人员还发现IPF患者肺和HLN中调节性T细胞（regulatory T cells）的积累。在IPF肺切片中，CD4⁺和CD8⁺ T细胞聚集在活动性纤维化区域周围。最后，当暴露于细胞外颗粒酶K时，人类肺上皮细胞显示出与纤维化、增殖和炎症相关基因的表达增加。总之，这些结果表明IPF肺和淋巴结的特征是产生颗粒酶K的T细胞的积累，并且颗粒酶K可以促进肺上皮细胞的促纤维化效应，提供了T细胞可能促进肺纤维化的潜在途径。

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性纤维化间质性肺病，导致高发病率和死亡率，患者平均生存期仅2-5年。现有抗纤维化药物仅能延缓少数患者进展，且副作用显著，肺移植仍是唯一根治性治疗。过去研究多聚焦于外周血T细胞，但组织特异性免疫在IPF中的作用尚不明确。既往研究发现IPF肺中CD8⁺ T细胞中颗粒酶B与颗粒酶K（granzyme K）比例向颗粒酶K偏移，且颗粒酶K可通过激活蛋白酶激活受体1（PAR1）促进成纤维细胞活化。然而，肺和肺引流淋巴结（HLN）中T细胞的表型、功能及定位仍需系统阐明。研究人员对48名IPF移植患者和50名非疾病对照的肺和HLN样本进行光谱流式细胞术、免疫荧光成像和体外功能实验，发现IPF肺和HLN中积累颗粒酶K产生、低功能的CD8⁺ T细胞，以及调节性T细胞（Treg）增多；T细胞在纤维化灶和蜂窝肺区域聚集；细胞外颗粒酶K可诱导肺上皮细胞促纤维化基因表达。这些发现为T细胞通过颗粒酶K参与IPF纤维化提供了潜在机制，论文发表在《Mucosal Immunology》。

主要关键技术方法包括：样本来源于48例IPF移植患者和50例非疾病对照器官捐献者；使用光谱流式细胞术（Cytek^? Aurora）分析单细胞悬液的表型和功能；对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺及HLN切片进行免疫荧光成像和免疫组化；采用PMA/离子霉素刺激后胞内染色评估细胞因子（IFNγ、TNFα）和丝氨酸蛋白酶（颗粒酶K、颗粒酶B）产生；通过CFSE标记和抗CD2/CD3/CD28刺激评估增殖能力；利用永生化肺泡上皮细胞（HuArlo）和原代支气管上皮细胞（气液界面培养）进行体外实验，结合RNA测序和多重免疫分析（LEGENDplex^?）检测细胞外颗粒酶K的影响。

**T细胞在肺和肺引流淋巴结中的表型差异**：通过流式细胞术发现，IPF肺中CD8⁺:CD4⁺ T细胞比例无显著差异，但IPF HLN中CD4⁺ T细胞比例增加。IPF HLN中CD8⁺效应记忆T细胞（TEM: CD45RA^?CCR7^?）比例增加，而na?ve T细胞减少；CD4⁺ T细胞在肺中TEM比例降低，但在HLN中TEM比例增加。IPF肺和HLN中调节性T细胞（Treg: CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺）比例均显著高于对照。组织驻留记忆T细胞（TRM）标志物CD69和CD103在两组间无差异。

**T细胞在蜂窝肺区域纤维化灶周围的积累**：通过免疫荧光和免疫组化，在IPF肺的致密纤维化区和蜂窝肺各段均发现CD4⁺和CD8⁺ T细胞聚集，常邻近成纤维细胞灶。颗粒酶K阳性细胞在IPF肺中增加，并与T细胞聚集区域共定位。定量分析显示，IPF肺中CD8⁺ T细胞占所有有核细胞的比例显著增加，而CD4⁺ T细胞无变化。

**IPF肺引流淋巴结中滤泡CD4⁺调节性T细胞的积累**：通过免疫荧光染色，在IPF HLN的滤泡内发现CD4⁺FOXP3⁺ Treg（fTreg）比例显著高于对照。

**IPF肺中低功能、颗粒酶K⁺ CD8⁺ T细胞的积累**：经PMA/离子霉素刺激后，IPF肺CD8⁺ T细胞产生更多颗粒酶K，但颗粒酶B无差异；颗粒酶K产生随年龄增加，但IPF的增幅超出年龄趋势。IPF肺CD8⁺ T细胞中IFNγ⁺TNFα⁺双阳性比例无差异，但颗粒酶K⁺细胞中双阳性比例显著低于颗粒酶B⁺细胞，表明颗粒酶K⁺细胞呈低功能。CD103表达在丝氨酸蛋白酶阴性细胞中最高，提示颗粒酶K⁺细胞较少为气道中心TRM。IPF肺CD4⁺ T细胞也呈现类似颗粒酶K增加和低功能模式。

**IPF来源HLN中颗粒酶K⁺ CD8⁺ T细胞的富集及生发中心细胞外颗粒酶K积累**：IPF HLN中CD8⁺ T细胞的颗粒酶K阳性比例增加，且随年龄增长，但IPF超出年龄预期。颗粒酶K⁺细胞主要定位于T细胞区，并在IPF和对照HLN的生发中心中观察到细胞外颗粒酶K积累。

**肺颗粒酶K⁺ CD8⁺ T细胞主要为不表达CD103的效应记忆T细胞并显示复制性衰老**：UMAP分析显示，颗粒酶K⁺ CD8⁺ T细胞主要为TEM，且多为CD69⁺CD103^? TRM，而颗粒酶B⁺细胞更可能为CD69⁺CD103⁺ TRM。CFSE增殖实验表明，颗粒酶K⁺ CD8⁺ T细胞在TCR刺激后增殖能力显著低于颗粒酶K^?细胞，且颗粒酶K含量随细胞分裂轻微增加，而颗粒酶B含量立即高且持续稳定，进一步支持颗粒酶K⁺细胞复制性衰老。

**细胞外颗粒酶K促进肺上皮细胞异常MHC II表达和IL-18产生增加**：将T细胞培养上清（刺激或未刺激）作用于HuArlo细胞后，RNA测序发现9697个差异表达基因，上调基因涉及MHC II类（HLA-DP1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DRA、HLA-DRB6）、MHC I类、整合素、基质金属蛋白酶MMP25和MMP28、趋化因子等。直接使用重组活化颗粒酶K处理HuArlo细胞后，ELISA检测到IL-8和IL-18分泌增加，IL-6、IL-33、IL-12p70无变化。处理原代支气管上皮细胞（气液界面）后，RNA测序显示上调基因涉及伤口修复（EGR1）、细胞周期和凋亡（NR4A1）、炎症（IL6）、屏障功能（MUC13）和AP1信号复合物（FOS）。两组实验重叠的102个差异表达基因主要涉及MHC II上调及信号传导（HLA-DQA1、HLA-DRB1、CD74、HLA-DMA、HLA-DMB）、细胞粘附（ITGAV、NEDD9、ITGB2）和MMP28。

讨论总结：研究人员通过对比IPF移植肺和HLN与非疾病对照，系统表征了T细胞表型、功能和定位。研究局限性包括：缺乏端粒长度数据、样本匿名化限制治疗影响评估、仅限终末期肺组织、未充分表征Treg功能。但该转化研究提供了颗粒酶K产生、衰老、低功能CD8⁺ T细胞在IPF肺中积累的证据，并表明细胞外颗粒酶K可诱导上皮细胞促纤维化变化，支持CD8⁺ T细胞参与IPF的假说。研究结论部分翻译如下：总之，研究人员发现IPF肺的特征是积累产生颗粒酶K、衰老、低功能的CD8⁺ T细胞。重要的是，CD4⁺和CD8⁺ T细胞持续存在于IPF肺的病理蜂窝肺区域附近，且细胞外颗粒酶K的施用促进了人源肺上皮细胞潜在促纤维化变化。这些数据进一步证明CD8⁺ T细胞可能参与IPF。