利用CRISPR/Cas9靶向突变水稻eIF(iso)4G基因增强水稻对水稻黄斑驳病毒抗性

《Molecular Plant Pathology》：Enhanced Rice Yellow Mottle Virus Resistance via CRISPR/Cas9-Targeted Mutagenesis of the Rice eIF(iso)4G Gene

　　

水稻是一种主食作物，主要以高含量的碳水化合物和蛋白质而闻名。水稻黄斑驳病（Rice yellow mottle disease，RYMD）是一种破坏性病害，影响撒哈拉以南非洲的稻田，由水稻黄斑驳病毒（Rice yellow mottle virus，RYMV）引起。开发抗病毒基因型是控制RYMV的高度推荐且有效的方法。利用感病（Susceptibility，S）基因中的隐性突变的遗传方法可能增强对病毒的抗性。报道表明，肯尼亚种植的大多数水稻基因型易受RYMV感染。基因组编辑在增强作物农艺性状方面已显示出前景。研究人员利用CRISPR-Cas9系统在籼稻（Indica）品种IR2793-80-01中获得了对RYMV的增强抗性。由于该基因的自然突变赋予RYMV隐性抗性，研究人员靶向了eIF(iso)4G感病基因。通过农杆菌（Agrobacterium）介导的转化，将表达靶向eIF(iso)4G基因的Cas9-OseIF(iso)4G-gRNA载体导入水稻愈伤组织。评估了10个T2代纯合突变株系对RYMV的反应，感染显著减少。T2突变株系与野生型植物之间的农艺性状无显著差异。CRISPR/Cas9介导的eIF(iso)4G基因敲除（knockout）等位基因赋予了对RYMV的增强抗性，可能被归类为部分抗性。研究结果强调了采用精确编辑策略（如引导编辑（prime editing））以产生更优抗性等位基因的需求。总体而言，该研究提供了一种替代的抗性增强策略，可创建敲除抗性等位基因，纳入RYMV抗性的育种计划中。

论文发表在《Molecular Plant Pathology》。研究背景方面，全球粮食需求预计到2050年翻倍，水稻在亚洲和撒哈拉以南非洲低收入国家粮食安全中至关重要。然而，水稻黄斑驳病毒（RYMV，属Sobemovirus科Solemoviridae）是撒哈拉以南非洲灌溉生态系统中的主要病原，造成显著产量损失。肯尼亚因人口增长和城市化的饮食变化导致水稻年需求超过国内生产近200%，且当地主栽籼稻品种IR2793-80-01普遍易感。传统育种中，O. sativa缺乏RYMV抗性基因，而从O. glaberrima中导入抗性基因（如RYMV₁、RYMV₂、RYMV₃）面临遗传不兼容挑战。已知RYMV₁对应真核翻译起始因子eIF(iso)4G的自然突变可赋予隐性抗性，但籼稻遗传转化困难限制了功能验证与育种应用。因此，研究人员旨在通过CRISPR/Cas9编辑籼稻IR2793-80-01的eIF(iso)4G基因，创制抗RYMV种质并优化其再生体系。

研究人员开展了籼稻IR2793-80-01愈伤组织诱导与再生培养基激素配比优化，构建靶向eIF(iso)4G基因的CRISPR/Cas9双sgRNA表达载体（含Cas9、hygromycin resistance gene (Hyg^R, hpt)），利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens EHA105）介导转化愈伤组织，经潮霉素筛选获得T₀植株，通过PCR验证T-DNA整合，Sanger测序与TIDE分析确认T₂代靶位点插入缺失（indels）及移码突变，评估突变体农艺性状（株高、穗长、分蘖数、千粒重），RT-qPCR检测eIF(iso)4G表达量，机械接种RYMV（S4株系）后通过症状观察、双抗体夹心酶联免疫吸附试验（DAS-ELISA）和RT-qPCR测定病毒积累量，以野生型IR2793-80-01、感病对照IR64及抗病对照Gigante为对照。样本为肯尼亚主栽籼稻IR2793-80-01及编辑后代T₀-T₂群体。

研究结果如下：

2.1 Efficient Regeneration of Rice Cultivar IR2793-80-01。研究人员通过优化2,4-D（3 mg/L）与6-benzylaminopurine（BAP，0.15 mg/L）组合的愈伤诱导培养基（CIM），使IR2793-80-01愈伤诱导率超80%；再生培养基（RM）含0.25 mg/L BAP、0.2 mg/L 1-naphthaleneacetic acid（NAA）和1 mg/L kinetin时再生频率约70%，解决了籼稻难再生问题。

2.2 Plasmid Construction。针对eIF(iso)4G（LOC_Os04g42140）设计两个sgRNA（sgRNA₁：GC 55%，效率98%；sgRNA₂：GC 65%，效率99%），靶向MIF4G域下游区域，构建pCRI-OsU3-sgRNA-35s-Cas9-hyg载体，经Sanger测序验证元件完整性。

2.3 Generation of Edited Plants。596个胚性愈伤经农杆菌转化与三轮潮霉素筛选，获得28个事件，转化效率13.4%，突变效率60.7%，T₀植株生根后移栽温室。

2.4 Molecular Characterisation of Transgenic Plants。PCR扩增T₀基因组，转基因植株检出560 bp Cas9片段与384 bp hpt片段，野生型无扩增，证实T-DNA整合；靶区域PCR产物大小差异提示编辑发生。

2.5 Seed Viability Test。T₀突变体（E1、E11、E25）种子萌发率与幼苗根长、苗长与野生型无差异，T₁、T₂世代生长正常。

2.6 Analysis of Sequences From Edited Lines to Identify Specific Mutations。T₂代Sanger测序显示靶位点发生1至29 bp缺失或2至17 bp插入，E3、E14、E16、E25、E1等为移码突变；ICE与TIDE分析确认sgRNA₂移码率可达100%，多数事件评为理想敲除（Ideal knockout, KO）。

2.7 Growth Analysis of Edited Plants。Dunnett's检验表明T₂突变体株高、穗数、分蘖数、穗长、千粒重与野生型无显著差异（p > 0.05），编辑未影响正常农艺性状。

2.8 Expression of eIF(iso)4G in Edited Lines。RT-qPCR显示移码突变体（E3、E14、E25等）eIF(iso)4G相对表达量显著下调至野生型0.3倍以下（p < 0.0001），以UBQ10归一化。

2.9 Evaluation of eIF(iso)4G Edited Lines for RYMV Resistance。T₂幼苗接种RYMV后，野生型7天现症，突变体平均13天现症，病害发生率降至约58%；DAS-ELISA与RT-qPCR显示E1、E3、E14、E16、E25病毒滴度显著降低至阴性水平（p ≤ 0.001），与抗病对照Gigante无显著差异，表现为部分抗性。

讨论部分总结：研究人员指出CRISPR/Cas9是解析基因功能与创制变异的有效工具，eIF(iso)4G作为病毒劫持的宿主翻译起始因子，其移码突变阻断VPg-eIF(iso)4G互作从而削弱病毒复制。本研究将籼稻IR2793-80-01转化效率提升至13.4%，优于既往Indica品种（如NGZ 4.8%-7.8%），归因于Plant Preservative Mixture（PPM）与愈伤干燥处理。双sgRNA在靶区产生多样indels且可稳定遗传，编辑植株获部分抗性而非Gigante的自然rymv1-2完全免疫，提示需采用引物编辑（prime editing）等精准策略模拟自然等位基因以实现完全抗性。结论为优化籼稻再生转化体系结合CRISPR/Cas9敲除eIF(iso)4G可在不影响农艺性状前提下赋予RYMV部分抗性，为抗病育种提供替代策略，未来应聚焦精准编辑模拟rymv1-2以完全抑制病毒增殖。