EMS诱变对层出镰刀菌的遗传和生理效应探究：对栲栳病管理、氮代谢和次生代谢产物生产的启示

《Plant Stress》：Exploring the Genetic and Physiological Effects of EMS Mutagenesis on Fusarium proliferatum: Implications for Pokkah Boeng Disease Management, Nitrogen Metabolism, and Secondary Metabolite Production

　　

甲基磺酸乙酯（EMS）诱变是开发微生物遗传多样性的常用技术。本研究探究了EMS诱变对中国甘蔗栲栳病（PBD）病原菌层出镰刀菌（F. proliferatum）的遗传和生物学效应。研究人员将野生型菌株（PB6-3）分别用0.0%、1.0%、2.5%、5.0%和7.5%的EMS浓度处理，处理时间分别为30、60、90和120分钟（mins），以建立EMS诱变体系。通过离体甘蔗叶片接种试验筛选EMS诱变菌株的毒力变化。相较于PB6-3，标记为MPB6-3的突变最显著菌株表现出毒力降低、表型改变以及生长和产孢能力下降。研究人员利用分子标记验证了MPB6-3中EMS诱变的成功诱导，后续研究表明，不同氮（N）源影响了菌株的生长和产孢率，以及植物激素和真菌毒素等次生代谢产物（SMs）的合成速率。研究显示，氮源显著影响了PB6-3和MPB6-3的代谢速率。值得注意的是，MPB6-3表现出不同的氮同化速率。研究结果凸显了EMS诱变在开发具有改变毒力和代谢物谱的生物突变体方面的适用性，也为层出镰刀菌提供了重要见解，从而为甘蔗制定新型病害防控策略。

**论文解读：EMS诱变对层出镰刀菌的遗传与生理效应及其对甘蔗栲栳病防控的启示**

**研究背景与研究问题**

栲栳病（PBD）是全球甘蔗产区，尤其是在中国、印度、南非和马来西亚等国家，导致严重产量损失的主要真菌病害。该病害主要由藤仓镰刀菌复合群（FFSC），包括层出镰刀菌（*Fusarium proliferatum*）引起，危害甘蔗幼嫩叶片，导致叶片扭曲、褪绿、节间缩短、茎秆弯曲和顶腐，严重时植株完全枯萎，严重影响甘蔗品质和产量。近年来，层出镰刀菌已成为中国PBD的主要病原菌。

在病原菌与寄主植物的互作中，氮素（N）有效性对真菌生长、次生代谢产物（SMs，包括植物激素和真菌毒素）的产生以及真菌-植物互作起着关键作用。不合理的氮肥施用可能增加病害发生率。此外，FFSC产生的植物激素如赤霉素（GA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、细胞分裂素和脱落酸（ABA）能调节植物生长和免疫系统，从而增强真菌致病性。同时，该复合群产生的真菌毒素如伏马菌素（FB）、串珠镰刀菌素、玉米赤霉烯酮、镰刀菌素C和白僵菌素，对人类和动物健康构成严重威胁。

甲基磺酸乙酯（EMS）诱变是植物育种中广泛应用的随机点突变诱导技术，具有突变率高、对材料损伤小、成本效益高等优点。然而，EMS诱变在真菌中的应用研究相对有限，尤其是在其对氮代谢和次生代谢产物产生的影响方面，尚有许多未知。因此，本研究旨在探究EMS诱变如何影响层出镰刀菌的形态、氮代谢以及次生代谢产物的产生，为开发新型甘蔗病害防控策略提供理论依据。

**主要技术方法**

1. **EMS诱变处理**：研究人员对野生型菌株PB6-3的孢子进行不同浓度（0.0%-7.5%）和不同时间（30-120分钟）的EMS处理，通过单孢分离获得稳定突变体。
2. **毒力与表型分析**：采用离体甘蔗叶片接种法评估菌株毒力；通过菌落形态、生长速率和产孢量进行表型分析。
3. **分子标记验证**：利用简单序列重复（SSR）分子标记（引物P3A126和P3A129）通过聚合酶链式反应（PCR）验证EMS诱变引起的基因组改变。
4. **氮代谢与基因表达分析**：将菌株培养于含不同氮源（硝酸钾、硝酸钙、氯化铵、碳酸氢铵、酵母提取物、甘氨酸、尿素）的培养基中，测定氮代谢相关酶（硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）、谷氨酸脱氢酶（GDH））活性，并通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析氮代谢相关基因（*AreA*和*MeaB*）的相对表达量。
5. **次生代谢产物检测**：采用离子交换树脂富集、超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）定量分析植物激素（GA₃、GA₄、GA₇）和真菌毒素（FB₁、FB₂、FB₃）。

**研究结果**

**1. 表型及离体叶片毒力测定**
研究证实，野生型菌株PB6-3在PDA培养基上形成规则圆形、菌丝松散旺盛的菌落，生长速率和产孢量高，接种后能在甘蔗品种ROC22和LC05-136上引起典型病斑，表明其具有强毒力。

**2. 不同EMS浓度和处理时间对形态、生长、产孢和毒力的影响**
研究发现，EMS处理导致菌落形态发生变化，如形成不规则辐射状边缘和浅紫色中心。随着EMS浓度和处理时间的增加，菌株生长速率和产孢量总体呈下降趋势。毒力分析显示，在7.5% EMS处理120分钟条件下，获得的菌株（MPB6-3）完全丧失致病性（无病斑），表现为致弱性。该菌株被选为后续研究的突变体。

**3. 基于分子标记的EMS诱变验证**
SSR分子标记结果证实，野生型PB6-3产生单一扩增条带，而突变体MPB6-3产生两条不同的条带，表明EMS诱变成功诱导了基因组多态性变化。

**4. 不同氮源对PB6-3和MPB6-3形态、生长速率和产孢的影响**
两种菌株均能利用7种氮源，但对不同氮源的偏好存在差异。硝酸盐（NO₃）源（如KNO₃）最有利于两者的生长。在产孢方面，PB6-3在Ca(NO₃)₂上的产孢量最高，而MPB6-3在酵母提取物（YE）上的产孢量最高，表明MPB6-3在氮源利用机制上可能发生了突变。

**5. 不同氮源对PB6-3和MPB6-3氮代谢酶活性的影响**
两种菌株的可溶性蛋白含量和氮代谢酶活性对不同氮源响应各异。MPB6-3在KNO₃、NH₄Cl和NH₄HCO₃中的NR活性高于PB6-3，表明其硝酸盐利用能力可能改变。GS活性在两者间无显著差异，但MPB6-3在有机氮源下的GS活性总体较高，暗示其更强的有机氮吸收能力。GOGAT活性在尿素（CH₄N₂O）中最高，但MPB6-3的GOGAT活性普遍低于PB6-3。GDH活性在有机氮源（YE）中达到最高，且PB6-3的活性显著高于MPB6-3。这些结果表明，EMS诱变可能改变了MPB6-3的氮同化途径和代谢模式。

**6. 不同氮源对PB6-3和MPB6-3植物激素和真菌毒素产生的影响**
两种菌株均能产生GA₃、GA₄和GA₇，其中GA₄含量最高。EMS诱变未显著改变GA的总体生产能力，但不同氮源影响其产量。在真菌毒素方面，MPB6-3在无氮对照（CK）条件下，FB₁、FB₂、FB₃的产生量均显著低于PB6-3，约为其1/4。然而，在NH₄Cl作为氮源时，MPB6-3的FB₁和FB₃产量显著升高，表明EMS诱变改变了氮依赖性的毒素生物合成调控。

**7. PB6-3和MPB6-3在不同氮源下氮代谢相关基因的相对表达分析**
氮代谢调控基因*AreA*和*MeaB*的表达水平在两种菌株间存在显著差异。在NH₄Cl中，PB6-3的*AreA*表达量是CK的30倍，而MPB6-3在KNO₃和CH₄N₂O中表达量极低。相反，MPB6-3在有机氮源（甘氨酸C₂H₅NO₂和YE）中，*AreA*和*MeaB*的表达量显著升高，表明突变体可能通过增强有机氮利用途径进行补偿。

**总结与讨论**

本研究通过EMS诱变成功获得了层出镰刀菌的致弱突变体MPB6-3，该突变体表现出生长缓慢、产孢减少和完全丧失毒力的特征。SSR分子标记验证了诱变的成功。研究进一步发现，EMS诱变显著改变了菌株对不同氮源的利用能力、氮代谢关键酶活性、氮代谢调控基因（*AreA*和*MeaB*）的表达模式，以及次生代谢产物（植物激素GA和真菌毒素FB）的产量。这些结果表明，EMS诱变能够有效改变层出镰刀菌的遗传特性，进而影响其氮代谢和致病性相关次生代谢产物的合成。

**研究结论**：本研究表明，利用EMS诱变可在层出镰刀菌中实现遗传多样性，导致毒力和次生代谢产物产生的改变。该发现对控制甘蔗病害（尤其是全球主要甘蔗病害之一的PBD）具有应用价值。对EMS诱变致弱菌株的筛选表明，EMS诱变可用于开发更具抗病性的甘蔗品种。此外，EMS诱变调控甘蔗中次生代谢产物产生的潜力，可用于控制作物中的真菌毒素污染，从而提升甘蔗产品的安全性和质量，尤其是在真菌毒素对人类和动物饲料构成严重风险的地区。本研究也证明了诱变技术在作物抗病性和次生代谢产物管理方面的实际应用价值，为未来提高甘蔗抗逆性和优化受影响产区生产实践奠定了基础。